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　　在天然產物,、香精香料,、食品風味分析、環(huán)境及車內空氣分析等領域中,，GC/MS是定性分析其中揮發(fā)性物質的最常用,、且最方便手段。在NIST,、Wiley等數據庫的幫助下,，我們可以輕松對GC/MS采集的未知物譜圖進行搜庫，以確定可能的疑似物,，然后再通過標準品對照來最終定性,。但如果質譜譜庫或數據庫本身沒有收錄的化合物，那要怎么來定性確定呢,？

　　在上一期的文章“質譜同位素輪廓分布信息幫助確定化合物的分子式”中,，我們提到了四極桿質譜上直接測定精確分子量和分子式，本期的內容將介紹在GC/MS上利用MassWorks軟件對未知化合物的分子離子和相關碎片離子的精確質量數進行測定,，并對其進行定性鑒別,。

　　GC/MS上的未知物鑒定

　　在MS分析中涉及的碎片離子，多年來積累了豐富的知識,，McLafferty在權威論文中系統(tǒng)地總結了這些知識,。在GC/MS分析中遇到的典型的EI碎片離子,，如表1所示。NIST譜庫和搜索軟件附帶的MS Interpreter應用程序也利用這些碎片離子的知識來進行NIST譜庫檢索,，并幫助闡述化合的結構。

　　如表1所示,，一些常見的碎片離子有多種可能,，如28 Da可能是-C2H4、-CO,、-N2中的任意一種,，而29Da可能是-C2H5或-CHO等。雖然精確質量數的測定可能有助于區(qū)分這些可能的碎片,，但我們想在本文中通過一個真實的例子來證明,，在全譜圖校正后，通過在MS的輪廓圖模式中觀察到的譜圖差異,，能更好地區(qū)分這些碎片,，而且是在圖形上更直觀地通過視覺區(qū)分，而不僅僅是單點精確質量測定,。此外,，我們將展示來自同一分子離子(M+)的不同碎片如何在概念上和圖形上通過譜圖準確度（Spectural Accuracy）的概念聯(lián)系在一起，用于結構說明和元素組成確定,。

　　表1：EI中常見的離子碎片

　　1 實驗部分：

　　樣品信息：MS校準調諧氣PFTBA （安捷倫GC/MSD自帶）,，樣品由天然產物制備

　　質譜條件：PFTBA和樣品均在MassHunter采集軟件下以Profile模式采集，掃描速度為 2^2 (A/D samples = 4),，質量范圍為 m/z 29-600,，離子閾值Treshold設置為零。MS源溫度230℃,，四極桿溫度150℃,。

　　數據分析: MassWorks? V6.0 軟件(Cerno Bioscience公司) 對MS數據進行精確質量和譜圖準確度測定。

　　圖1：通過外標法的PFTBA完成MS的精確質量和譜圖校正

　　圖2：經MassWorks校正后的樣品數據

　　2 結果：

　　鑒定可能的分子離子(M+)

　　對于圖2中Rt=7.4 min的未知化合物,，m/z為168,，其精確質量為168.1416 Da的離子可能是分子離子(M+)，它將作為本次未知物鑒定的研究對象,。使用圖3所示的參數設置進行CLIPS檢索會得到一個可能的元素組成的候選列表,，如圖4所示。

　　排名第一的分子式(C11H20O+)和第二個分子式(C10H20N2+)的譜圖準確度均超過99.0%,，校準的MS譜圖與理論MS譜圖之間幾乎完美匹配,。第三名的分子式(C9H16N2O+)的譜圖準確度僅為98.5%，在M+1附近存在明顯的譜圖誤差,，更具體地說,，與校準的MS譜圖在M+1附近不擬合,，對應元素組成中因為少了兩個碳原子使得M+1處的豐度較小。

　　排名第一的分子式到第二的分子式,，碳原子數量減少了一個碳(從C11H20O+的11個C減少到C10H20N2+的10個C),，M+1信號應該有明顯的減少。但實際的結果表明,，兩個氮原子以及與之相關的來自15N的M+1信號的增加在某種程度上彌補了少一個13C的豐度降低,，而第一個分子式中存在的一個氧原子由于其缺乏自然的17O同位素因而對M+1信號沒有豐度貢獻。

　　圖3：MassWorks分析時CLIPS檢索的參數設置

　　圖4：按譜圖準確度排序產生的候選分子式的CLIPS檢索結果列表（上圖）,，第一個候選分子式(中圖)和第三個(底圖)的校正譜圖（紅色）與理論譜圖（藍色）的疊加

　　43 Da 碎片丟失的鑒定

　　通過上述對M+ 離子的譜圖準確度分析,，包括各種較高豐度的同位素的分析，將可能的元素組成縮小到前2個候選分子式,。

　　其它 EI 碎片離子的存在,，包括基峰m/z 125 離子，現在將被用于幫助確定元素組成,，并闡明其可能的結構,。利用所有可用的 EI 碎片和NIST譜庫，可以輕松地執(zhí)行譜庫檢索,，結果如圖 5 所示,。雖然NIST檢索給出的候選結果第1名確實與圖4中CLIPS檢索的第1名具有相同的元素組成，但其檢索的匹配分值低于800,，以及 m/z 125,、69、55,、41 和 27處的關鍵碎片上的無法匹配,，這表明該化合物可能是NIST譜庫沒有收錄的該分子式的不同同分異構體。有趣的是,，NIST檢索的所有前10個候選結果都包含至少一個氧,，m/z 125的碎片離子的較高豐度要么與元素組成中的包含的多個氧原子有關，要么與化學結構中OH基團中包含的單個氧原子有關,，這是關于該化合物結構可能范圍的重要線索,。

　　圖5：Rt =7.4 min 峰NIST檢索結果表明該未知化合物在庫中不存在，最高得分僅為789

　　考慮到M+離子m/z 168和豐度最強的碎片m/z 125的質量差為 43 Da,，參考表 1 所列的常見碎片,，43 Da碎片似乎有兩種可能，CH3CO (含氧)或CH3CH2CH2 (無氧),。CLIPS檢索中可使用的Ion series分析來測量和比較這兩種不同的可能性,。

　　未知分子要失去一個CH3CO碎片，首先必須包含至少一個氧原子,，這就只剩下CLIPS結果中第1名的分子式C11H20O+成為可能,。通過將從M+離子m/z 168至碎片離子m/z 125這一段的MS譜圖作為一個整體進行譜圖的擬合分析（見圖6）,，就可以從圖形擬合度上直接測量和評估整體的譜圖準確度。在整體譜圖準確度僅為97.0 %的情況下,，M+ 的所有同位素都存在顯著而系統(tǒng)的譜圖漂移,，丟失碎片CH3CO不太可能。此外,，碎片離子m/z 125的“A +1”處可明顯觀察到理論譜圖的豐度要高于實際的校正譜圖,，可能說明該理論譜圖的分子式中的碳原子個數超過了真實的碳數，這表明丟失的43Da碎片是CH3CH2CH2 的可能性更大,。圖7顯示了43 Da碎片丟失為CH3CH2CH2的譜圖擬合結果，整體的譜圖準確度為98.1%,，M+在m/z 168處沒有出現漂移,，碎片離子m/z 125的“A+1”處也擬合完美，這清楚地表明CH3CH2CH2是正確的43 Da碎片丟失,。

　　圖6：丟失CH3CO碎片情形下的校準譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍色)的擬合比較,，譜圖準確度為97.0%

　　圖7：丟失CH3CH2CH2碎片情形下的校準譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍色)的擬合比較，譜圖準確度為98.1%

　　氧原子的問題

　　在確認43Da碎片丟失為CH3CH2CH2后,，CLIPS結果中的第1和第2個候選分子式,，C11H20O+和C10H20N2+，都能產生該碎片,，因此還是不能確定二者之中哪一個是正確的元素組成,。在m/z 107 Da處的另一個較小碎片離子的存在可能有助于解決這個難題。該碎片與基峰m/z 125的質量差為18 Da,，它可能是m/z 125進一步的碎片產物,。根據表1中列出的常見片段，18 Da的丟失有一個明確的候選結果——H2O,。圖8顯示了包含碎片CH3CH2CH2和額外的H2O丟失的整體譜圖擬合結果,，包括在更寬的MS范圍(m/z 106~172)中，整體的譜圖準確度為97.2%,。譜圖準確度偏低的主要是由于在這三個碎片離子之間還存在譜圖干擾,，例如，m/z 109, 111和132這三個含量很低的碎片離子并未參與剛才的譜圖擬合建模,，因而降低了整體的譜圖準確度,。m/z 109和111處離子的含量較低，猜測可能是由于丟失O和CH2,，如圖9所示,，驗證了這一假設，其譜圖準確度提高到了97.6%,。這就表明CLIPS結果中的排序第一的分子式——C11H20O,，它是唯一可行的元素組成,，其通過丟失一個氧原子來形成所觀察到的這些碎片離子。

　　圖8：同時分析丟失一個CH3CH2CH2和一個額外的H2O的情況,，校準譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍色)擬合的譜圖準確度為97.2%

　　圖9：相較于圖8,，將m/z 109和m/z 111也加入譜圖的擬合分析，校準譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍色)擬合的譜圖準確度提高至97.6%

　　其它的小碎片

　　使用相同的方法,，可以通過CLIPS的Ion series來特征分析其他較小的碎片或碎片簇,，并確定它們各自的元素組成。圖10顯示了從C3至C8一系列的碳氫碎片的分析結果,。將這些較小的碎片與之前分析過的較大碎片相結合,，有助于拼湊出未知化合物的可能結構。

　　圖10：當使用CLIPS檢索分析m/z 55附近的離子簇時,，整體的譜圖準確度達到了98.2%,，以揭示出該處含有的可能的碳氫碎片，其他的離子簇也進行了類似的分析,，并給出了碎片的結果

　　ChemSpider檢索和可能的結構

　　在NIST檢索結果中找不到合理的碎片離子匹配結果,，而MassWorks軟件的CLIPS檢索結果已經給出了分子離子和碎片離子的可能元素組成，我們借助ChemSpider數據庫對可能結構進行檢索(見圖11),，該化合物的可能結構很可能與ChemSpider檢索結果中的第二個結構非常相似,。正確的分子可能是包含一個通過連接到碳上的OH基團的單個氧原子，位于碳氫鏈的中間或接近末端,，其余的碳氫鏈包含最多8個碳(最大的碎片為m/z 107,，如圖10所示)。

　　圖11：ChemSpider檢索到的可能的結構

　　結論：

　　即使在NIST等標準譜庫中沒有收錄目標化合物,，通過將MassWorks軟件中的CLIPS Ion series分析和其他網絡搜索(如ChemSpider)相結合,，也可以幫助拼湊出未知化合物的可能結構類型，以供進一步研究或考慮,。需要注意的是,，在EI硬電離的模式下，分子離子有可能被完全打碎,，使得未知化合物的質譜譜圖中沒有分子離子,，這種情況下，為了更好地鑒定未知物,，就需要考慮用軟電離的模式,，如CI、FAB等電離方式,，獲取分子離子,。

　　關于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數據定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質量,，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式,。MassWorks軟件同樣適用于高分率質譜（TOF、Orbitrap）的定性分析,。

　　關于綠綿科技

　　綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商,，負責Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產品市場推廣,、銷售,、售前/售后技術支持、應用支持,。

　　若您想了解獲取 MassWorks 產品的更多信息或應用,，歡迎致電綠綿科技！