同位素標(biāo)記化合物的合成和生產(chǎn)中,，很難獲得純品,，如氘代,、14C,、¹⁵N等標(biāo)記的化合物通常含有一定量的未標(biāo)記化合物,，雖然質(zhì)譜法是檢測和定量標(biāo)記化合物的最廣泛和最直接的方法，但是標(biāo)記和未標(biāo)記的化合物的各種同位素的A和A+1,，…，A+n峰的質(zhì)譜峰信號重疊相互重疊,，使得尤其是存在多個(gè)標(biāo)記位置的環(huán)或存在Cl,、Br元素的化合物，他們的質(zhì)譜信號重疊更為復(fù)雜,，即使是使用高分辨率的質(zhì)譜系統(tǒng)（如TOF,、Orbitrap）也難以準(zhǔn)確解決定量的問題。

盡管一些文獻(xiàn)報(bào)道中提出了各種質(zhì)譜信號的重疊校正方案,，但即使在50%（50﹕50）高濃度的標(biāo)記與未標(biāo)記混合物,，其校正誤差也大于±10%，這使得對5-10%的低濃度的混合物的可靠定量幾乎不可能實(shí)現(xiàn)的,。

通過MassWorks的TrueCal^TM技術(shù)對測量的質(zhì)譜信號峰進(jìn)行峰形校正,，來提高質(zhì)譜系統(tǒng)對同位素峰型的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy），以確保使用多元最小二乘法擬合能從校準(zhǔn)的質(zhì)譜圖中計(jì)算出每個(gè)同位素峰的“真實(shí)”貢獻(xiàn),。

考察兩種同位素峰分布復(fù)雜度不同的化合物：第一種是含有一個(gè)Cl原子的D2標(biāo)記化合物——Hydrochlorothiazide-3,3-d2 (HCT-d2),，第二種是含有兩個(gè)Cl原子且¹⁴C 標(biāo)記在苯環(huán)上的化合物——雙氯酚酸鈉,。選擇了三種質(zhì)譜系統(tǒng)來評儀器定量分析同位素標(biāo)記物的的適用性：ThermoFisher LTQ/Orbitrap、Agilent LC/MSD和WatersXevo TQ LC/MSMS,。 在每個(gè)MS系統(tǒng)上,，首先在Profile模式下測量純的未標(biāo)記化合物，然后將其進(jìn)行峰形校正,，以評估可實(shí)現(xiàn)的譜圖準(zhǔn)確度,。 再利用譜圖準(zhǔn)確度，對同位素標(biāo)記的兩種化合物進(jìn)行計(jì)算來獲得它們中含有的各種標(biāo)記和未標(biāo)記離子的相對濃度,。

D2標(biāo)記含Cl化合物——HCT-d2

未標(biāo)記的HCT（C7H6N3O4S2Cl）在LTQ/Orbitrap下采集的Profile模式數(shù)據(jù),，使用MassWorks處理，獲得的譜圖準(zhǔn)確度約為97.3%（見圖1）,，標(biāo)記后的HCT-d2的譜圖準(zhǔn)確度又有明顯下降,，僅為96.2%，將D2標(biāo)記和未標(biāo)記的HCT按50%：50%混合后的譜圖準(zhǔn)確度下降更為嚴(yán)重,，只能達(dá)到92.5%（見圖2）,，導(dǎo)致的結(jié)果就是MassWorks給出的兩者的相對濃度出現(xiàn)了±10%的誤差，這種誤差下要準(zhǔn)確計(jì)算標(biāo)記和未標(biāo)記的含量顯然是不可能的,。

圖1 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測定的HCT（C7H6N3O4S2Cl）的同位素譜圖準(zhǔn)確度

圖2 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測定的HCT-d2（C7H4N3O4S2ClD2）的同位素譜圖準(zhǔn)確度

將測試轉(zhuǎn)移到單四極桿的Agilent LC/MSD系統(tǒng)上,，測得的未標(biāo)記的HCT的譜圖準(zhǔn)確度高達(dá)99.0%，標(biāo)記的HCT-d2的譜圖準(zhǔn)確度為98.9%,，50%：50%混合物的譜圖準(zhǔn)確度為98.7%（見圖3）,，結(jié)果表明，單四極桿的LC/MSD的同位素譜圖準(zhǔn)確度測定準(zhǔn)確,。然后進(jìn)一步考察HCT和HCT-d2按不同比例混合的MassWokrs定量測試效果,，每一個(gè)濃度測定3次，然后數(shù)據(jù)對比實(shí)際的混合濃度和MassWorks軟件計(jì)算出來濃度值,，結(jié)果見圖4,，結(jié)果表明，平均濃度誤差反映了測量偏差或系統(tǒng)偏差均小于0.6%,，且要小于標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD＜1%）,。HCT-d2的實(shí)際混合濃度值與軟件計(jì)算值的線性相關(guān)系數(shù)R²=0.9996，預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)誤差SEP=0.53%,。

圖3 未標(biāo)記的HCT（上）,、標(biāo)記的HCT-d2（中）、HCT/HCT-d2= 50:50的混合物（下）,，紅色曲線為校正的同位素譜圖,，黑色為理論的同位素譜圖

圖4 使用MassWorks的分析得到的不同濃度HCT的定量分析結(jié)果

圖5 HCT-d2的計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的線性關(guān)系

¹⁴C標(biāo)記含Cl化合物——HCT-d2

雙氯芬酸鈉(C14H10NO2Cl2Na)，含有2個(gè)Cl原子，苯環(huán)上可被標(biāo)記的¹⁴C的數(shù)量為0~6個(gè),，¹⁴C標(biāo)記后的化合物的同位素峰分布比HCT-d2更為復(fù)雜,，使用LTQ/Orbitrap應(yīng)對7種潛在共存混合物的準(zhǔn)確定量任務(wù)來說是一個(gè)挑戰(zhàn)。然而,，當(dāng)用Waters Xevo TQ LC/MSMS測量時(shí),，從供應(yīng)商購買的放射性的¹⁴C標(biāo)記化合物的譜圖準(zhǔn)確度達(dá)到了98.9%（見圖6），MassWorks軟件計(jì)算出來的0~6個(gè)¹⁴C標(biāo)記化合物的各自的濃度比（圖7）,，計(jì)算出來的總的放射性比活性為62.6%,，這與供應(yīng)商提供的62.7 mCi/mmol值非常一致。圖8為按不同比例混合的標(biāo)記和未標(biāo)記化合物的定量分析結(jié)果,，標(biāo)記物的混合濃度值與軟件計(jì)算濃度值的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9989,，預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)誤差SEP=1.98%。

圖6 未標(biāo)記雙氯酚酸鈉（上）和標(biāo)記的雙氯酚酸鈉（下）的譜圖準(zhǔn)確度結(jié)果

圖7 MassWorks給出的標(biāo)記的雙氯酚酸鈉的校正質(zhì)譜圖及其中所有化合物的相對含量

圖8 使用MassWorks的多元線性分析得到的不同濃度雙氯芬酸鈉的定量分析結(jié)果

圖9 雙氯芬酸鈉14C標(biāo)記物的計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的線性關(guān)系

關(guān)于MassWorks 軟件

MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件,，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS,、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式,。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF,、Orbitrap）的定性分析。

關(guān)于綠綿科技

綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商,，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks,、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售,、售前/售后技術(shù)支持,、應(yīng)用支持。

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