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譜圖準確度分析幫助確定未知物的元素組成和可能的結(jié)構(gòu)

　　在GC/MS的定性分析中,，豐富EI碎片離子對于鑒別未知化合物非常有用，特別是當化合物已經(jīng)被收錄進NIST或Wiley等譜庫時,，我們可以非常方便地通過譜庫檢索來鑒別未知化合物,。但如果該化合物沒有被收錄在譜庫中，我們通過使用傳統(tǒng)的單四極桿GC/MS系統(tǒng),，也能夠用分子離子M+和相關(guān)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)測定來對這些未知化合物進行鑒別,。

　　在MS分析中涉及的碎片離子,，多年來積累了豐富的知識,，McLafferty在權(quán)威論文中系統(tǒng)地總結(jié)了這些知識,。在GC/MS分析中遇到的典型的EI碎片離子，如表1所示,。NIST譜庫和搜索軟件附帶的MS Interpreter應(yīng)用程序也利用這些碎片離子的知識來進行NIST譜庫檢索,，并幫助闡述化合的結(jié)構(gòu)。

　　如表1所示,，一些常見的碎片離子有多種可能,，如28 Da可能是-C2H4、-CO,、-N2中的任意一種,，而29Da可能是-C2H5或-CHO等。雖然精確質(zhì)量數(shù)的測定可能有助于區(qū)分這些可能的碎片,，但我們想在本文中通過一個真實的例子來證明,，在全譜圖校正后，通過在MS的輪廓圖模式中觀察到的譜圖差異,，能更好地區(qū)分這些碎片可以,，而且是在圖形上更直觀地通過視覺區(qū)分，而不僅僅是單點精確質(zhì)量測定,。此外,，我們將展示來自同一分子離子(M+)的不同碎片如何在概念上和圖形上通過譜圖準確度（Spectural Accuracy）的概念聯(lián)系在一起，用于結(jié)構(gòu)說明和元素組成確定,。

表1：EI中常見的離子碎片

實驗部分：

　　樣品信息：MS校準調(diào)諧氣PFTBA （安捷倫GC/MSD自帶）,，樣品由天然產(chǎn)物制備

　　質(zhì)譜條件：PFTBA和樣品均在MassHunter采集軟件下以Profile模式采集，掃描速度為 2^2 (A/D samples = 4),，質(zhì)量范圍為 m/z 29-600,，離子閾值Treshold設(shè)置為零。MS源溫度230℃,，四極桿溫度150℃,。

　　數(shù)據(jù)分析: MassWorks? V6.0 軟件(Cerno Bioscience公司) 對MS數(shù)據(jù)進行精確質(zhì)量和譜圖準確度測定。

圖1：通過外標法的PFTBA完成MS的精確質(zhì)量和譜圖校正

圖2：經(jīng)MassWorks校正后的樣品數(shù)據(jù)

結(jié)果：

鑒定可能的分子離子(M+)

　　對于圖2中Rt=7.4 min的未知化合物,，m/z為168,，其精確質(zhì)量為168.1416 Da的離子可能是分子離子(M+)，它將作為本次未知物鑒定的研究對象,。使用圖3所示的參數(shù)設(shè)置進行CLIPS檢索會得到一個可能的元素組成的候選列表,，如圖4所示。

　　排名第一的分子式(C11H20O+)和第二個分子式(C10H20N2+)的譜圖準確度均超過99.0%,，校準的MS譜圖與理論MS譜圖之間幾乎完美匹配,。第三名的分子式(C9H16N2O+)的譜圖準確度僅為98.5%，在M+1附近存在明顯的譜圖誤差,，更具體地說,，與校準的MS譜圖在M+1附近不擬合,，對應(yīng)元素組成中因為少了兩個碳原子使得M+1處的豐度較小。

　　排名第一的分子式到第二的分子式,，碳原子數(shù)量減少了一個碳(從C11H20O+的11個C減少到C10H20N2+的10個C),，M+1信號應(yīng)該有明顯的減少。但實際的結(jié)果表明,，兩個氮原子以及與之相關(guān)的來自15N的M+1信號的增加在某種程度上彌補了少一個13C的豐度降低,，而第一個分子式中存在的一個氧原子由于其缺乏自然的17O同位素因而對M+1信號沒有豐度貢獻。

圖3：MassWorks分析時CLIPS檢索的參數(shù)設(shè)置

圖4：按譜圖準確度排序產(chǎn)生的候選分子式的CLIPS檢索結(jié)果列表（上圖）,，第一個候選分子式(中圖)和第三個(底圖)的校正譜圖（紅色）與理論譜圖（藍色）的疊加

43 Da 碎片丟失的鑒定

　　通過上述對M+ 離子的譜圖準確度分析,，包括各種較高豐度的同位素的分析，將可能的元素組成縮小到前2個候選分子式,。

　　其它 EI 碎片離子的存在,，包括基峰m/z 125 離子，現(xiàn)在將被用于幫助確定元素組成,，并闡明其可能的結(jié)構(gòu),。利用所有可用的 EI 碎片和NIST譜庫，可以輕松地執(zhí)行譜庫檢索,，結(jié)果如圖 5 所示,。雖然NIST檢索給出的候選結(jié)果第1名確實與圖4中CLIPS檢索的第1名具有相同的元素組成，但其檢索的匹配分值低于800,，以及 m/z 125,、69、55,、41 和 27處的關(guān)鍵碎片上的無法匹配,，這表明該化合物可能是NIST譜庫沒有收錄的該分子式的不同同分異構(gòu)體。有趣的是,，NIST檢索的所有前10個候選結(jié)果都包含至少一個氧,，m/z 125的碎片離子的較高豐度要么與元素組成中的包含的多個氧原子有關(guān)，要么與化學結(jié)構(gòu)中OH基團中包含的單個氧原子有關(guān),，這是關(guān)于該化合物結(jié)構(gòu)可能范圍的重要線索,。

圖5：Rt =7.4 min 峰NIST檢索結(jié)果表明該未知化合物在庫中不存在，最高得分僅為789

　　考慮到M+離子m/z 168和豐度最強的碎片m/z 125的質(zhì)量差為 43 Da,，參考表 1 所列的常見碎片,，43 Da碎片似乎有兩種可能，CH3CO (含氧)或CH3CH2CH2 (無氧),。CLIPS檢索中可使用的Ion series分析來測量和比較這兩種不同的可能性,。

　　未知分子要失去一個CH3CO碎片，首先必須包含至少一個氧原子,，這就只剩下CLIPS結(jié)果中第1名的分子式C11H20O+成為可能,。通過將從M+離子m/z 168至碎片離子m/z 125這一段的MS譜圖作為一個整體進行譜圖的擬合分析（見圖6）,，就可以從圖形擬合度上直接測量和評估整體的譜圖準確度。在整體譜圖準確度僅為97.0 %的情況下,，M+ 的所有同位素都存在顯著而系統(tǒng)的譜圖漂移,，丟失碎片CH3CO不太可能,。此外,，碎片離子m/z 125的“A +1”處可明顯觀察到理論譜圖的豐度要高于實際的校正譜圖，可能說明該理論譜圖的分子式中的碳原子個數(shù)超過了真實的碳數(shù),，這表明丟失的43Da碎片是CH3CH2CH2 的可能性更大,。圖7顯示了43 Da碎片丟失為CH3CH2CH2的譜圖擬合結(jié)果，整體的譜圖準確度為98.1%,，M+在m/z 168處沒有出現(xiàn)漂移,，碎片離子m/z 125的“A+1”處也擬合完美，這清楚地表明CH3CH2CH2是正確的43 Da碎片丟失,。

圖6：丟失CH3CO碎片情形下的校準譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍色)的擬合比較,，譜圖準確度為97.0%

圖7：丟失CH3CH2CH2碎片情形下的校準譜圖(紅色)和理論譜圖 (藍色)的擬合比較，譜圖準確度為98.1%

氧原子的問題

　　在確認43Da碎片丟失為CH3CH2CH2后,，CLIPS結(jié)果中的第1和第2個候選分子式,，C11H20O+和C10H20N2+，都能產(chǎn)生該碎片,，因此還是不能確定二者之中哪一個是正確的元素組成,。在m/z 107 Da處的另一個較小碎片離子的存在可能有助于解決這個難題。該碎片與基峰m/z 125的質(zhì)量差為18 Da,，它可能是m/z 125進一步的碎片產(chǎn)物,。根據(jù)表1中列出的常見片段，18 Da的丟失有一個明確的候選結(jié)果——H2O,。圖8顯示了包含碎片CH3CH2CH2和額外的H2O丟失的整體譜圖擬合結(jié)果,，包括在更寬的MS范圍(m/z 106~172)中，整體的譜圖準確度為97.2%,。譜圖準確度偏低的主要是由于在這三個碎片離子之間還存在譜圖干擾,，例如，m/z 109, 111和132這三個含量很低的碎片離子并未參與剛才的譜圖擬合建模,，因而降低了整體的譜圖準確度,。m/z 109和111處離子的含量較低，猜測可能是由于丟失O和CH2,，如圖9所示,，驗證了這一假設(shè)，其譜圖準確度提高到了97.6%,。這就表明CLIPS結(jié)果中的排序第一的分子式——C11H20O,，它是唯一可行的元素組成,，其通過丟失一個氧原子來形成所觀察到的這些碎片離子。

圖8：同時分析丟失一個CH3CH2CH2和一個額外的H2O的情況,，校準譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍色)擬合的譜圖準確度為97.2%

圖9：相較于圖8,，將m/z 109和m/z 111也加入譜圖的擬合分析，校準譜圖(紅色) 和理論譜圖 (藍色)擬合的譜圖準確度提高至97.6%

其它的小碎片

　　使用相同的方法,，可以通過CLIPS的Ion series來特征分析其他較小的碎片或碎片簇,，并確定它們各自的元素組成。圖10顯示了從C3至C8一系列的碳氫碎片的分析結(jié)果,。將這些較小的碎片與之前分析過的較大碎片相結(jié)合,，有助于拼湊出未知化合物的可能結(jié)構(gòu)。

圖10：當使用CLIPS檢索分析m/z 55附近的離子簇時,，整體的譜圖準確度達到了98.2%,，以揭示出該處含有的可能的碳氫碎片，其他的離子簇也進行了類似的分析,，并給出了碎片的結(jié)果

ChemSpider檢索和可能的結(jié)構(gòu)

　　在NIST檢索結(jié)果中找不到合理的碎片離子匹配結(jié)果,，而MassWorks軟件的CLIPS檢索結(jié)果已經(jīng)給出了分子離子和碎片離子的可能元素組成，我們借助ChemSpider數(shù)據(jù)庫對可能結(jié)構(gòu)進行檢索(見圖11),，該化合物的可能結(jié)構(gòu)很可能與ChemSpider檢索結(jié)果中的第二個結(jié)構(gòu)非常相似,。正確的分子可能是包含一個通過連接到碳上的OH基團的單個氧原子，位于碳氫鏈的中間或接近末端,，其余的碳氫鏈包含最多8個碳(最大的碎片為m/z 107,，如圖10所示)。

圖11：ChemSpider檢索到的可能的結(jié)構(gòu)

結(jié)論：

　　精確的質(zhì)量測定對于化合物鑒定非常重要,，但還不足以幫我們確定出明確的元素組成,，而譜圖準確度已經(jīng)一次又一次地證明，它不僅有助于縮小可能的候選元素組成的數(shù)量,，而且有助于理解和提出可能的結(jié)構(gòu),。當一個或多個碎片可用時，通過將所有關(guān)鍵碎片納入分析并將它們作為一個整體進行測量和比較各種假設(shè),，以幫助判斷哪種假設(shè)最有可能得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)的支持,，并有助于得出關(guān)于鑒別化合物元素組成及其可能結(jié)構(gòu)的合理結(jié)論。即使在NIST等標準譜庫中沒有收錄目標化合物,，通過將MassWorks軟件中的CLIPS Ion series分析和其他網(wǎng)絡(luò)搜索(如ChemSpider)相結(jié)合,，也可以幫助拼湊出未知化合物的可能結(jié)構(gòu)類型，以供進一步研究或考慮,。

關(guān)于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件,，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式,。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF,、Orbitrap）的定性分析。

關(guān)于綠綿科技

　　綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商,，負責Cerno公司旗下的MassWorks,、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售,、售前/售后技術(shù)支持,、應(yīng)用支持。

　　若您想了解獲取 MassWorks 產(chǎn)品的更多信息或應(yīng)用,，歡迎致電綠綿科技,！