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前言

　　全柱成像毛細(xì)管等電聚焦(iCIEF)電泳已成為生物制藥領(lǐng)域治療性單克隆抗體(mAb)電荷異質(zhì)性分析的一項(xiàng)重要技術(shù),，無需傳統(tǒng)CIEF方法的遷移步驟即可通過紫外實(shí)時(shí)成像的方式完成蛋白分離和定量檢測,。除了電荷異構(gòu)體的定量分析之外，通過在線電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)的方式直接表征分離的電荷異構(gòu)體對于研究單克隆抗體的產(chǎn)品質(zhì)量,、安全性和有效性至關(guān)重要,。iCIEF-MS串聯(lián)技術(shù)將iCIEF的高分離效率與MS的強(qiáng)大的表征能力相結(jié)合，可以對單克隆抗體的電荷變體進(jìn)行深度表征,。

　　<本文節(jié)選并譯自 Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022;1–9.>

　　單克隆抗體由于性質(zhì)和制造復(fù)雜,，容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，特別是電荷異質(zhì)性,。單抗的儲存降解也會產(chǎn)生電荷異質(zhì)性,，從而對結(jié)合效率和治療效果產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響。全柱成像毛細(xì)管等電聚焦(iCIEF)技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域經(jīng)常被用于電荷異質(zhì)性的測定,，在治療性單抗的開發(fā)和質(zhì)量控制中已經(jīng)被公認(rèn)為是一種非?？煽康某Ｒ?guī)方法。

　　iCIEF采用毛細(xì)管全柱成像檢測(WCID)的方式監(jiān)測抗體的分離過程并通過紫外法對抗體含量進(jìn)行定量檢測,，整個(gè)檢測無需傳統(tǒng)CIEF方法的遷移步驟,，在許多情況下已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的CIEF方法而成為生物制藥領(lǐng)域中電荷異質(zhì)性分析的首選方法，因?yàn)樗哂懈鼉?yōu)越的分辨率,，沒有遷移步驟，從而縮短了分析時(shí)間(每個(gè)樣品<15分鐘),，減少了費(fèi)力的樣品制備,，以及更快的方法開發(fā)時(shí)間。

　　抗體電荷異質(zhì)性的研究除了各電荷異構(gòu)體的分離及定量之外,，通過電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)直接表征分離電荷異構(gòu)體,，對于確保單克隆抗體的產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性也至關(guān)重要,。

CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細(xì)管電泳系統(tǒng)

　　AES公司創(chuàng)新的分析兼制備的CEInfinite 全柱成像iCIEF系統(tǒng),，成功地實(shí)現(xiàn)了iCIEF與ESI-MS串聯(lián)，通過將iCIEF的高分離效率和UV定量結(jié)果與MS的表征能力相結(jié)合，可以對單克隆抗體電荷異構(gòu)體進(jìn)行深度表征,。只需簡單的優(yōu)化方法參數(shù),，就能成功地將單抗的各電荷異構(gòu)體峰從iCIEF轉(zhuǎn)移至MS分析。盡管電荷異構(gòu)體峰從iCIEF轉(zhuǎn)移出來的過程中會在一定程度上降低異構(gòu)體峰間的分辨率,，但借助高分辨的MS平臺,，即使是從低豐度的電荷異構(gòu)體中分離出完整的單抗電荷異構(gòu)體，包括脫酰胺,、糖基化修飾等,，都可以被高精度地表征出來。這就為生物制藥應(yīng)用中的單抗電荷異質(zhì)性表征提供了巨大的潛力,。

　?。?）iCIEF-MS串聯(lián)系統(tǒng)的組成

圖1A展示了CEInfinite和Thermo Orbitrap Fusion Lumos 串聯(lián)的示意圖。CEInfinite電泳系統(tǒng)包括一臺自動進(jìn)樣器,，一個(gè)用于加壓遷移的蠕動泵,，以及一個(gè)成像檢測器(UV)、一個(gè)iCIEF毛細(xì)管卡盒（包含三個(gè)部分：進(jìn)樣毛細(xì)管,、分離毛細(xì)管,、轉(zhuǎn)移毛細(xì)管）。iCIEF毛細(xì)管卡盒的進(jìn)樣毛細(xì)管端連接到自動進(jìn)樣器內(nèi)的六通閥接口,，轉(zhuǎn)移毛細(xì)管端連接ESI接口,。樣品通過六通閥導(dǎo)入iCIEF毛細(xì)管卡盒的分離毛細(xì)管部分，兩端的電極分別浸入陽極液和陰極液液面以下,。電極施加高電壓后,，抗體在分離毛細(xì)管中完成iCIEF分離，之后由蠕動泵提供動力,，將轉(zhuǎn)移流速控制在10 ~ 80 nl/min(分離毛細(xì)管內(nèi)徑為200μm),，這時(shí)分離毛細(xì)管內(nèi)的電荷異構(gòu)體將依次被轉(zhuǎn)移至ESI源電離并進(jìn)行MS分析。

圖1 (A) CEInfinite iCIEF與ESI-MS串聯(lián)的原理圖,，iCIEF系統(tǒng)帶自動進(jìn)樣器,、注射泵、毛細(xì)管柱,，毛細(xì)管柱出口連接ESI接口,；(B) 曲妥珠單抗的iCIEF-UV譜圖(濃度2 mg/ml)。聚焦電壓:1500V (1 min)+3000V (10 min),。UV 280 nm 檢測,；(C) Orbitrap Fusion Lumos采集的曲妥珠單抗的總離子流圖（m/z 1500-4000）。

　?。?）iCIEF-MS分析曲妥珠單抗

　　圖2展示了曲妥珠單抗電荷異構(gòu)體的iCIEF-MS分析結(jié)果,。從圖2A可看出共有4個(gè)電荷異構(gòu)體的峰被分離并鑒定，包括一個(gè)堿性峰、一個(gè)主峰,、兩個(gè)酸性峰,。圖2E的主峰解卷積結(jié)果表明，主峰的主糖型(G0F/G0F)的質(zhì)量為148 058.4 Da,，與理論質(zhì)量148 057.2 Da相差8 ppm,。

　　圖2D的堿性峰解卷積結(jié)果表明，堿性峰也含同樣含有低豐度單糖基G0F,、G1F和G2F,，其完整分子量相對主峰差了?19.4 Da，這說明是由Asn (?17 Da)或Asp/isoAsp (?18 Da)形成琥珀酰亞胺,。圖2F顯示了酸性峰#1解卷積結(jié)果,，酸性峰#1的分子量與主峰相差+1.2 Da，酸性峰#2（圖2未展示）的分子量與主峰相差+1.8 Da,，這表明它們分別是經(jīng)過單次脫酰胺修飾和兩次脫酰胺修飾形成,。

圖2 iCIEF-MS分析曲妥珠單抗：(A) 曲妥珠單抗TIC-MS，m/ z1500-4000,；(B) 主峰質(zhì)譜圖,；(C) 主峰質(zhì)譜圖局部放大；(D) 堿性峰解卷積結(jié)果,；(E) 主峰解卷積結(jié)果,；(F) 酸性峰#1的解卷積譜結(jié)果。

　?。?）iCIEF-MS分析fusion mAb

　　圖3展示了分子量190 KDa的融合單抗的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結(jié)果,。我們能清楚地看到UV和MS圖譜中的各個(gè)電荷異構(gòu)體峰能一一對應(yīng)。這兩個(gè)單抗主峰中含量最豐富的糖基G0F/G0F的分子量測定精度分別為15ppm(圖3A)和18ppm(圖3B),，SD分別為2 ppm(n=3)和3ppm (n=5),。盡管獲得的質(zhì)量精度較低，但較小的SD值仍能幫助我們可靠地測定主峰與堿性峰和酸性峰的質(zhì)量差異,。圖3A中單抗堿性峰的質(zhì)量與主峰相比差了?19 Da (SD 2 ppm,n=3),，圖3B中的單抗堿性峰的質(zhì)量差了?20 Da (SD 3 ppm,n=5)，表明該分子可能已在肽水平上進(jìn)行了焦谷氨酸修飾(?18 Da),。酸性峰A1,、A2、和A3的質(zhì)量增加了6 Da,，最有可能是因于脫酰胺形成的不同電荷異構(gòu)體。

圖3 融合抗體的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結(jié)果

　　參考文獻(xiàn)：略

　　原文請參考：Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022,；1–9.

　　https://doi.org/10.1002/elps.202200170

　　當(dāng)然,，如果要進(jìn)行更深度的表征以確定修飾位點(diǎn)和修飾類型，僅僅依靠iCEIF-MS獲得的完整分子量信息還不夠，這時(shí)我們可借助CEInfinite的餾分收集功能,，對iCIEF分離的電荷異構(gòu)體餾分收集后進(jìn)行酶解,，再使用HPLC-MSMS進(jìn)行肽圖表征。

　　我們在下一期的iCIEF的專題中,，將為您分享餾分收集功能在電荷異構(gòu)體表征中的應(yīng)用,。