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mRNA疫苗或藥物的生產(chǎn)工藝,，主要分為質(zhì)粒DNA原液制備,、mRNA原液制備,、mRNA制劑制備三個階段,。本文討論第三階段的工藝平臺，也是當(dāng)前挑戰(zhàn)大的環(huán)節(jié),。

　　關(guān)鍵的制劑技術(shù)突破解決了mRNA的成藥性問題,，使其從60年的科研之路走向臨床商業(yè)化應(yīng)用,，并在此次新冠疫苗應(yīng)用中大放異彩,。據(jù)公開信息， BNT162b2和mRNA-1273 2021年累計銷售額超過580億美元,。

　　mRNA制劑的主要工藝環(huán)節(jié)包括mRNA的包封/裝載,、復(fù)合物純化、除菌過濾,、無菌灌裝等,，如下圖。整個制劑工藝的核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的選擇以及mRNA的包封/裝載,，其余步驟采用的是現(xiàn)有成熟工藝,。以當(dāng)前主流的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)載體為例,，僅相關(guān)問題，就足夠頭疼,。

▲ mRNA制劑生產(chǎn)工藝流程

　　1 mRNA原液復(fù)融

　　如果mRNA原液經(jīng)冷凍儲存或運輸,，那么其復(fù)融工藝是不容忽視的。具體原因和可用復(fù)融設(shè)備與質(zhì)粒DNA原液復(fù)融類似,。需要注意的是,，mRNA分子的穩(wěn)定性要遠低于質(zhì)粒DNA，復(fù)融過程中需要注意避免重結(jié)晶,。

　　2 mRNA包封/裝載

　　包封/裝載工藝的基礎(chǔ)是遞送系統(tǒng)的設(shè)計開發(fā),。良好設(shè)計的遞送系統(tǒng)才能使mRNA分子進入人體后避免被RNA酶降解、被有效遞送至靶點,、穿過細胞膜并在胞內(nèi)釋放,。目前主流是采用非病毒遞送系統(tǒng)，包括基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)（如核酸脂質(zhì)體復(fù)合物(lipolexes),、陽離子脂質(zhì)體）,、基于聚合物的遞送系統(tǒng)（如polyplexes）、基于脂質(zhì)和聚合物的遞送系統(tǒng)（如lipopolyplexes）等,。

　　以目前主流的LNP為例,，其直徑約100 nm，由多種脂質(zhì)成分組成,。Moderna公布的脂質(zhì)成分包括可電離陽離子磷脂：中性輔助磷脂：膽固醇：PEG修飾磷脂,，摩爾比為50:10:38.5:1.5。如下圖,，mRNA（紅色）與離子化的脂質(zhì)分子帶正電荷的末端結(jié)合形成復(fù)合物,，脂質(zhì)的疏水端向外與輔助脂質(zhì)（藍色、綠色,、黃色）疏水端結(jié)合,，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。

▲ LNP的成分及mRNA包封結(jié)構(gòu)

　　mRNA-LNP包封制備的關(guān)鍵,，除了脂質(zhì)成分配方外,，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質(zhì)成分的接觸和相互作用過程,，以形成穩(wěn)定,、均一、收率高的mRNA-LNP復(fù)合物,。公開報道的LNP制備方法有超聲波,、剪切、均質(zhì)（高壓&微射流）,、擠出等,。

　　Pfizer/BioNTech采用的是碰撞噴射混合器 (IJM) ,，能夠配制和生產(chǎn)帶有 API 的高質(zhì)量脂質(zhì)納米顆粒（例如用于 mRNA 疫苗）。 活性藥物成分與脂質(zhì)的封裝過程基于碰撞噴射混合技術(shù),，其中兩股流在碰撞噴射混合室中高速碰撞,。一個流包含有機溶劑中的脂質(zhì)，另包含水中的 API 高速混合會降低脂質(zhì)的溶解度,，從而形成均勻的納米顆粒,。 納米粒子的質(zhì)量取決于流的流動穩(wěn)定性、混合器幾何形狀和流體速度,。作為后一步,，混合物被稀釋防止顆粒聚集。

▲ KNAUER 沖擊式射流混合器

▲ KNAUER LNP包封設(shè)備

　　不同的廠家可能采用不同的微流控混合/擠出技術(shù),，尤其是微流道的設(shè)計,，但通過兩相混合形成包封復(fù)合物這一原理是一致的。影響終產(chǎn)品質(zhì)量的因素除了兩相溶液自身成分特性,、具體微流控混合/擠出技術(shù)外,，還包括兩相溶液的注入溫度、壓力,、流量,、比率等。

▲ PreciGenome 兩相混合包封技術(shù)

▲ PNI NxGen混合包封技術(shù)

　　Pfizer/BioNTech采用的是碰撞噴射混合器 (IJM）,，該設(shè)備較傳統(tǒng)微流控設(shè)備通量大,，更適合中試以及生產(chǎn)過程，完善的GMP要求相關(guān)文件,，無一次性耗材等優(yōu)點,，使得大規(guī)模生產(chǎn)變?yōu)榭赡堋Ｄ壳癒NAUER已推出實驗室級別設(shè)備-IJM NanoScaler,，更多信息可聯(lián)系綠綿科技15201316651（微信同號）,。

　　3 超濾純化

　　mRNA包封后需要純化去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質(zhì)材料,，并調(diào)整終復(fù)合物濃度,、置換溶劑緩沖體系、調(diào)節(jié)pH值等,，此步驟通常通過超濾/切向流過濾實現(xiàn),，mRNA-LNP復(fù)合物被截留,，雜質(zhì)及溶劑被洗濾,。

　　超濾工藝為成熟技術(shù)，可選中空纖維或板式膜包,，關(guān)鍵的還是根據(jù)mRNA-LNP復(fù)合物的粒徑選擇合適的截留孔徑,。根據(jù)終制劑成品的配方要求,，純化后的mRNA-LNP溶液可能還需要進行制劑配液，添加必要的輔料成分,，以利于產(chǎn)品的長期穩(wěn)定保存和體內(nèi)藥效發(fā)揮,。超濾和配液相關(guān)的設(shè)備耗材品牌可見前兩篇。

　　4 除菌過濾

　　此步除菌過濾是終產(chǎn)品無菌保障的關(guān)鍵,，一般采用0.22μm除菌級過濾器冗余設(shè)置,，截留細菌等微生物污染物。按照當(dāng)前的法規(guī)要求,，必須要進行使用后濾器完整性檢測以確保終產(chǎn)品的無菌性,。

　　除菌過濾為現(xiàn)有成熟技術(shù)，可用一次性囊式濾器或套筒式濾器,，常見材質(zhì)有聚醚砜（PES）,、聚偏二氟乙烯（PVDF）等。在選擇時重點關(guān)注材質(zhì)與產(chǎn)品的兼容性,、溶出析出特性,、通量及通量的衰減等。常用除菌過濾器品牌可見前兩篇,。

　　5 無菌灌裝

　　對于無菌注射劑產(chǎn)品,，灌裝技術(shù)需根據(jù)產(chǎn)品包裝容器來選擇。以mRNA疫苗所用西林瓶為例,，無菌灌裝過程包括容器和膠塞的準(zhǔn)備,、灌裝、加塞,、軋蓋,、燈檢等步驟。

　　西林瓶的準(zhǔn)備步驟主要是洗瓶,、干燥和除菌除熱原,，大規(guī)模生產(chǎn)時，行業(yè)常用洗烘灌聯(lián)動線進行連續(xù)化生產(chǎn),。膠塞的準(zhǔn)備過程主要是清洗和滅菌,，可以在生產(chǎn)前采用清洗機和滅菌柜進行準(zhǔn)備或直接采用免洗免滅菌的無熱原膠塞。

▲ 自動化連續(xù)無菌灌裝加塞

　　由于灌裝過程為開放式操作,，無菌污染的控制是為關(guān)鍵的,，要考慮到人員、設(shè)備,、物料,、環(huán)境和操作方法等方面，如無菌灌裝、加塞及產(chǎn)品未完全密封時的轉(zhuǎn)移等操作均需要在A級環(huán)境進行,。

　　灌裝線常見的品牌包括Syntegon, B+S, IMA, Optima, Romaco/楚天, ROTA/奧星, 東富龍等,。隨著一次性使用系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，灌裝機廠家開始與耗材廠家合作推出一次性灌裝系統(tǒng),，如Syntegon與Sartorius推出的PreVAS, 一次性使用耗材廠家也能提供灌裝耗材定制服務(wù),，如Pall, Merck, Avantor, Meissner, 樂純等。

　　6 包裝儲存運輸

　　完成灌裝和質(zhì)檢的mRNA制劑產(chǎn)品,，根據(jù)儲存運輸要求被冷凍至儲存溫度,，之后完成運輸包裝以便于全球流通。對于需要冷凍儲存的mRNA產(chǎn)品,，有必要在儲存和運輸過程進行持續(xù)的溫度監(jiān)測,，以證明其始終處于規(guī)定的儲存溫度范圍，否則不能保證終患者給藥時產(chǎn)品的安全性和有效性,。

▲ mRNA疫苗成品進行冷凍儲存

　　寫在后

　　雖然mRNA新冠疫苗仍是當(dāng)前上市的mRNA產(chǎn)品,，然而理論上通過mRNA可以編碼任何人類需要的蛋白，不論是作為疫苗還是治療性藥物,。Moderna公開的在研管線就包括了預(yù)防性疫苗,、全身性細胞內(nèi)治療、局部再生療法,、全身性分泌和細胞表面治療,、癌癥疫苗、腫瘤內(nèi)免疫腫瘤治療等,。

　　據(jù) Nature 2021年9月份的綜述預(yù)測,，mRNA新冠疫苗在mRNA藥物市場的占比將隨著更多mRNA產(chǎn)品獲批上市而逐年下降，10年后將低于50%,，更多mRNA產(chǎn)品將得以應(yīng)用,。

▲ mRNA產(chǎn)品市場演變預(yù)測

　　我國《“十四五”醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃》明確提出加快核酸疫苗技術(shù)平臺建立，推動相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化,，支持疫苗企業(yè)和重要原輔料,、耗材、生產(chǎn)設(shè)備,、包裝材料企業(yè)協(xié)作,，提高各類產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)水平?？梢妋RNA技術(shù)平臺是一定要突破的,。

　　整個mRNA制劑工藝流程中，核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的設(shè)計和包封工藝,，其余部分采用的是現(xiàn)有成熟技術(shù),。由于mRNA遞送技術(shù)當(dāng)前仍處于不斷摸索和更新中,，未來仍有很多可變性和提升空間，目前仍很難將其稱作平臺工藝,，相信隨著更多研究和應(yīng)用數(shù)據(jù)的積累，遞送技術(shù)平臺將逐步完善,。另一方面,，mRNA-LNP配方體系仍需要優(yōu)化以提升制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性，降低對冷凍儲存和運輸?shù)囊?，從而更利于mRNA產(chǎn)品的流通和臨床應(yīng)用,。

　　此文對mRNA制劑工藝平臺進行梳理的目的，在于讓同行更為了解整個工藝平臺及現(xiàn)有資源,，以便于提升自身的工作效率,；同時，讓更多同行了解國內(nèi)與國際品牌在工藝平臺能力上的差距,，看到努力的方向,。

　　文章內(nèi)容僅基于筆者的知識經(jīng)驗、信息梳理和總結(jié),，可能存在錯誤或疏漏,，還請廣大讀者批評指正，歡迎留言評論更正或補充,，感謝,！

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　　注：部分參考信息、圖片和視頻來源于網(wǎng)絡(luò),。

　　參考文獻

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來源：生物創(chuàng)客