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浙江大學(xué)用戶與臺(tái)灣中興大學(xué)再次合作,，在Rapid Commun. Mass Spectrom上發(fā)表文章《 Identification of new minor metabolites of penicillin G in human serum by multiple-stage tandem mass spectrometry》，采用MassWorks在四極桿質(zhì)譜上測(cè)定了青霉素G的8種新代謝產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù),，并對(duì)血漿中微量代謝物進(jìn)行了確證,。

多級(jí)質(zhì)譜確證人血清中青霉素G新的微量代謝產(chǎn)物

Hsin-Pin Ho¹, Ren-Jye Lee¹, Chung-Yu Chen¹, Soo-Ray Wang², Zu-Guang Li1,³

and Maw-Rong Lee¹*

1  Department of Chemistry, National Chung Hsing University, Taichung 40227, Taiwan, R.O.C.

2  Department of Interncel Medicine, Chung Shan Medical University and Chung Shan Medical University Hospital,

Taichung 40201, Taiwan, R.O.C.

3  College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014  Zhejiang, P.R. China

摘要：液相色譜質(zhì)譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法常被用于藥物代謝物的研究。雖然這兩種方法已經(jīng)解決了代謝物鑒定及結(jié)構(gòu)表征的分析,，但是仍然是比較耗時(shí)的,。本文中，一種新的多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜方法用于人血清中青霉素G的微量代謝產(chǎn)物-一種β-內(nèi)酰胺抗生素的鑒定及結(jié)構(gòu)表征的分析,。青霉素G的七種微量代謝產(chǎn)物包括5種I相代謝產(chǎn)物和2種II相代謝產(chǎn)物通過(guò)應(yīng)用LC-MSⁿ數(shù)據(jù)分析方法而得到確證,。青霉素G的七種代謝產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)通過(guò)質(zhì)譜校正軟件（MassWorks）得到確證。本文的LC-MSⁿ數(shù)據(jù)分析方法能夠在代謝分析中提供微量代謝產(chǎn)物的豐富的,、必要的結(jié)構(gòu)信息,。

前言

略

實(shí)驗(yàn)

化學(xué)試劑

所有化學(xué)試劑均為分析純，青霉素G（99.7%）購(gòu)自Riedel-deHae¨n（Sseelze,，德國(guó)）,。青霉素G的代謝產(chǎn)物青霉噻唑鹽購(gòu)自Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）.色譜級(jí)的甲醇、乙腈,、甲酸購(gòu)自Merck（Darmstadt,，德國(guó)）。用水為經(jīng)過(guò)Milli-Q（大于18.2MΩ,，Millipore,，法國(guó)）凈化的超純水。青霉素G和青霉素噻唑鹽儲(chǔ)備液（1000 ug/ml）用高純水制備,。青霉素G和青霉素噻唑鹽的混合工作液（100 ug/ml）用超純水稀釋到相應(yīng)的濃度,。儲(chǔ)備液儲(chǔ)存在0℃冰箱中。

體內(nèi)血清樣品的制備

略

色譜條件

液相色譜分離系統(tǒng)為LC1100（安捷倫科技,，Santa Clara,，CA,USA）帶有二元泵和在線脫氣裝置。Phenomenex Luna C18柱和C18 預(yù)柱用于液相分離,，流速為0.2 ml/min,。流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。進(jìn)樣量5 ul，梯度洗脫程序如下：

質(zhì)譜條件

LTQ-線性離子阱質(zhì)譜儀（Thermo,，San Jose,，CA,USA）帶ESI離子源,。將青霉素G和青霉素噻唑鹽以10 ul/min的流速經(jīng)流動(dòng)注射泵直接注入ESI源得到質(zhì)譜調(diào)諧條件,，流動(dòng)相為40%A,，流速為0.2 ml/min，經(jīng)T型管路與流動(dòng)注射連接,。優(yōu)化的離子化及離子傳輸條件如下：鞘氣流速為29arb,，輔助氣流速為5arb,，噴霧電壓為正離子模式4kv，毛細(xì)管溫度為275℃,，毛細(xì)管電壓為41V，透鏡電壓為125V,。在多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中,，質(zhì)譜分析的參數(shù)如下：分離寬度為3.00Th,，碰撞能量為25%，Q為0.25,，激活時(shí)間為30ms。

數(shù)據(jù)分析條件

為了得到足夠的結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)減少數(shù)據(jù)采集,，設(shè)置LTQ的條件如下：（1）執(zhí)行數(shù)據(jù)分析的篩查,，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),；（2）設(shè)置選擇性數(shù)據(jù)分析掃描方法,；（3）得到母離子和中性丟失離子數(shù)據(jù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行確證,；（4）解析LC/MSⁿ數(shù)據(jù),。

一個(gè)四項(xiàng)掃描設(shè)計(jì)用于數(shù)據(jù)分析的掃描,。質(zhì)譜掃描中，個(gè)掃描事件為全掃模式,，掃描范圍為148-1000m/z，第二個(gè)掃描事件為相關(guān)產(chǎn)物離子的MSⁿ掃描，通過(guò)動(dòng)態(tài)排除得到高于預(yù)設(shè)強(qiáng)度的大量的質(zhì)譜峰,。動(dòng)態(tài)排除的參數(shù)為：重復(fù)3次,，重復(fù)持續(xù)時(shí)間為30,，排除列表的大小為100,，排除持續(xù)時(shí)間為30。根據(jù)初步的數(shù)據(jù)分析,，有針對(duì)的數(shù)據(jù)分析掃描能夠得到目標(biāo)代謝物的更多結(jié)構(gòu)表征信息,。

經(jīng)過(guò)有針對(duì)性的數(shù)據(jù)分析掃描，在Xcalibur軟件中多級(jí)質(zhì)譜的色譜圖上可以得到母離子和中性丟失離子的數(shù)據(jù),。母離子數(shù)據(jù)通過(guò)在MS2上提取特定的碎片離子而得到,，中性丟失離子數(shù)據(jù)也是通過(guò)在MS2上提取中性丟失離子而得到。

質(zhì)量數(shù)評(píng)估

開始采集數(shù)據(jù)前,，進(jìn)一針5ug/ml的包括青霉素G,、青霉素噻唑鹽、土霉素和玉米黃素的混合校正溶液。得到的輪廓圖數(shù)據(jù)應(yīng)用MassWorks軟件（Serno,Bioscience,Monmouth）對(duì)不對(duì)稱峰形和質(zhì)量數(shù)進(jìn)行校正,。接著進(jìn)實(shí)際樣品,。同樣,，LC/MS方法得到的輪廓圖數(shù)據(jù)也應(yīng)進(jìn)行峰形和質(zhì)量數(shù)的校正,。后,，基于質(zhì)量數(shù)和譜圖準(zhǔn)確度得到所有可能的分子式。

結(jié)果討論

青霉素G和青霉素噻唑鹽的碎片

略

體內(nèi)代謝分析

略

質(zhì)量數(shù)測(cè)定

單位質(zhì)量分辨率質(zhì)譜對(duì)定性分析僅提供粗略的質(zhì)量確證，因此需要質(zhì)量數(shù)測(cè)定,。本文采用MassWorks軟件確證檢測(cè)的代謝產(chǎn)物的分子式,。結(jié)果如表2所示,。質(zhì)量誤差小于25.5mDa,。質(zhì)量精度在96.1%-99.2%范圍內(nèi)。由于外部校正的應(yīng)用和可能的空間效應(yīng)對(duì)離子阱的影響,，目標(biāo)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量誤差僅能控制在50 mDa內(nèi)。良好的同位素輪廓圖校正提供的信息能夠?qū)δ繕?biāo)物分子式進(jìn)行確證,。

表2 青霉素G及其代謝物的質(zhì)量數(shù)

青霉素G的代謝途徑

    略

實(shí)際樣品檢測(cè)

略

結(jié)論

略。

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