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繼甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心周?chē)魅蔚龋?/span>MassWorks質(zhì)譜校正技術(shù)在Rapid Commun. Mass Spectrom（2011, 25, 3097–3102）發(fā)表高水平外文文章后，浙江大學(xué)用戶在Industrial & Engineering Chemistry Research（美國(guó)）上發(fā)表英文文章《Application of Multivariate Curve Resolution Method in the Quantitative Monitoring Transformation of Salvianolic Acid A Using Online UV Spectroscopy and Mass Spectroscopy》，采用MassWorks在單四極桿質(zhì)譜上測(cè)定了丹酚酸A兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)，并利用譜圖準(zhǔn)確度實(shí)現(xiàn)了對(duì)這兩種產(chǎn)物分子式的準(zhǔn)確識(shí)別。

多元曲線分辨法在在線紫外光譜和質(zhì)譜定量檢測(cè)丹酚酸A轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

Xintian Zheng，Xingchu Gong，Qin Li，Haibin Qu

（浙江大學(xué)藥物信息研究所）

摘要：本文應(yīng)用在線紫外光譜檢測(cè)分析系統(tǒng)對(duì)丹酚酸A（SAA）的轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行了探索性研究。一種基于多元曲線分辨的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法應(yīng)用于解決反應(yīng)物濃度和譜圖分布問(wèn)題從而評(píng)價(jià)動(dòng)力學(xué)分布。為研究溫度和pH兩個(gè)因素對(duì)SAA轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響，動(dòng)力學(xué)測(cè)試將溫度設(shè)定在25-90℃，pH值設(shè)定在2.5-10范圍內(nèi)。SAA轉(zhuǎn)化過(guò)程中首先發(fā)生降解反應(yīng)，當(dāng)溫度升高時(shí)，SAA的降解速度加快。當(dāng)pH值高于7時(shí)，SAA轉(zhuǎn)化速度加快，當(dāng)pH值小于6.5時(shí)則可保持穩(wěn)定。用MassWorks軟件結(jié)合單四極質(zhì)譜測(cè)定了SAA的兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)，并借助譜圖準(zhǔn)確度實(shí)現(xiàn)了對(duì)這兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的確證。結(jié)果表明，在中藥制劑生產(chǎn)過(guò)程中，作為主要生物活性物質(zhì)的SAA不應(yīng)在高溫和高pH值條件下生產(chǎn)。

1 前言

丹酚酸A（SAA）是丹參的主要有效成分，具有多種藥理活性，包括抗血小板、抗肝纖維素化、消炎、抗癌等特性¹。SAA的這些功能據(jù)推測(cè)源于其強(qiáng)大的抗氧化性^2-7。因此，SAA作為一種新的待開(kāi)發(fā)藥物在制藥領(lǐng)域受到廣泛的青睞。作為咖啡酸和丹參素的三聚體，SAA在水溶液中和丹參的某些制備過(guò)程中是不穩(wěn)定的⁸。在整個(gè)加工過(guò)程中加熱或強(qiáng)酸強(qiáng)堿都可能導(dǎo)致SAA的轉(zhuǎn)化。無(wú)疑，SAA的穩(wěn)定性將會(huì)影響SAA制備藥物的功效和安全性。

至今，對(duì)中藥材不穩(wěn)定生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化或降解的研究較少^9-11。而且這些研究都是應(yīng)用離線檢測(cè)方法。這些離線檢測(cè)方法通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)轉(zhuǎn)化很慢時(shí)可適用。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)化速度較快時(shí)，水解、氧化和沉淀等副反應(yīng)在離線樣品測(cè)定過(guò)程中可能同時(shí)發(fā)生。因此，需要一種實(shí)用、快速且無(wú)損的在線監(jiān)測(cè)方法，如連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)。這種在線監(jiān)測(cè)具有重現(xiàn)性好、過(guò)程自動(dòng)化、樣品和試劑消耗低等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)還可對(duì)降解過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究¹²。

本文采用在線紫外光譜檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)了SAA的轉(zhuǎn)化過(guò)程。多元曲線分辨法可用于解決吸收分布、反應(yīng)物光譜提取和輔助定量等問(wèn)題。結(jié)果用于動(dòng)力學(xué)模型而得到速率常數(shù)。MassWorks軟件結(jié)合單四極質(zhì)譜分析提供了有關(guān)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能標(biāo)示的確證信息。

2 材料和方法

2.1 試劑和藥品：純度大于95%的SAA及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過(guò)HPLC分析，在本實(shí)驗(yàn)室得到分離純化。色譜級(jí)乙腈和甲酸分別購(gòu)自Merck（Darmstadt，德國(guó)）和Tedia（Fairfield，OH，USA）。高純水通過(guò)Millipore Milli-Q系統(tǒng)（Milford，MA,USA）制備。其他化學(xué)物質(zhì)均為分析純。

2.2 儀器條件：T6紫外分光光度計(jì)（Pukinje,Beijing,China）帶win5軟件（Pukinje,Beijing,China），用于光譜采集，設(shè)置如下：掃描范圍220-400nm，數(shù)據(jù)間隔1nm，中等掃描速度，5mm石英流通池通路。

    連續(xù)流路由K501泵（Lumtech Analytical，Germany）、一個(gè)水浴反應(yīng)器，一個(gè)流通池和一個(gè)蠕動(dòng)泵管（200cm*2mm ID）組成。過(guò)程中，泵以20ml/min的流速連續(xù)提供樣品，樣品溶液在9s內(nèi)到達(dá)檢測(cè)器流通池。在線紫外分光光度分析系統(tǒng)示意圖如圖1所示。

圖1 在線紫外分光光度法分析系統(tǒng)示意圖，P為二元泵，流速20ml/min.T為溫度控制系統(tǒng).PC為光譜采集的工作站.水浴設(shè)置不同的溫度如表1所示。

   安捷倫單四極桿質(zhì)譜（Agilent, IL,USA）帶ESI接口用于質(zhì)譜檢測(cè)分析。所有樣品通過(guò)過(guò)濾器直接注入質(zhì)譜分析而不過(guò)柱子分離。流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。流速為0.5ml/min。高純氮用作干燥氣。電噴霧負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管溫度350℃，毛細(xì)管電壓3500V，干燥氣流速10ml/min，霧化氣電壓40psi。全掃質(zhì)譜分析，譜圖掃描在100-800m/z范圍內(nèi)。掃描數(shù)據(jù)以完整模式存儲(chǔ)用于MassWorks（Cerno Bioscience）分析。同時(shí)，離子閾值設(shè)為0，采集速率為0.05。

2.3 步驟：略。

2.4 多元曲線分辨法：略。

2.5 反應(yīng)產(chǎn)物的確證：不同的時(shí)間間隔，應(yīng)用質(zhì)譜法采集和分析每份20ul的樣品，來(lái)確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。為得到穩(wěn)定的信號(hào)，每個(gè)樣品掃描2min。得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassWorks軟件分析。SAA作為純標(biāo)準(zhǔn)用于內(nèi)標(biāo)校正。MassWorks軟件提供了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的計(jì)算的質(zhì)量數(shù)和可能的分子式。

3. 結(jié)果和討論

3.1 SAA轉(zhuǎn)化中溫度和pH的影響：略。

3.2 MCR-ALS分析轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：略。

3.3 動(dòng)力學(xué)計(jì)算：略。

3.4  SAA轉(zhuǎn)化過(guò)程的質(zhì)譜分析：本實(shí)驗(yàn)的MCR結(jié)合UV分析方法沒(méi)有排除反應(yīng)終產(chǎn)物為單組分的多種物質(zhì)共存的情況。本實(shí)驗(yàn)提到的反應(yīng)中，同樣動(dòng)力學(xué)分布得到的許多物質(zhì)的分子式（例如，兩種物質(zhì)具有相同的濃度分布和譜圖分布）能夠產(chǎn)生所謂的譜圖矩陣秩脫。所以，許多物質(zhì)被認(rèn)為是許多不同分子結(jié)構(gòu)的混合物，而不是單一分子結(jié)構(gòu)的純凈物。

反應(yīng)系統(tǒng)中化學(xué)物通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)和MassWorks軟件的進(jìn)一步證實(shí)進(jìn)行確證。MassWorks軟件能夠提供這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)。采用包括質(zhì)荷比和峰形的全面校正得到較高的譜圖準(zhǔn)確度，達(dá)到更準(zhǔn)確的組分檢測(cè)³⁴。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰為509和491。結(jié)果列于表2和表3，說(shuō)明在反應(yīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C₂₆H₂₁O₁₁和C₂₆H₁₉O₁₀。結(jié)果與我們之前研究的SAA（C₂₆H₂₂O₁₀,[M-H]- M/Z=493）90℃下在水溶液中被氧化，反應(yīng)產(chǎn)物包括丹酚酸C（C₂₆H₂₀O₁₀，[M-H]- M/Z=491）異丹酚酸C（C₂₆H₂₀O_10, [M-H]- m/z=491）和兩種新的多酚酸（C₂₆H₂₂O₁₁，[M-H]- M/Z=509）³⁵的結(jié)果相同。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖如圖7所示，基于MCR得到這些產(chǎn)物的質(zhì)譜。4種氧化產(chǎn)物相似的紫外光譜圖如圖8。MCR-ALS軟模式分離和鑒定的的每個(gè)物質(zhì)的光譜圖說(shuō)明其有著本質(zhì)的區(qū)別。相反，MCR結(jié)合紫外光譜方法是一種有效的方法，不需要分離，因此，其在在線化學(xué)過(guò)程監(jiān)測(cè)中是一種很有用的方法。

表2  MassWorks軟件分析的SAA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分子離子[M-H]^-m/z=491^a的結(jié)果

^a表示主要基于譜圖準(zhǔn)確度得到的前十個(gè)可能結(jié)果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當(dāng)量

表3  MassWorks軟件分析的SAA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分子離子[M-H]^-m/z=509^a的結(jié)果

^a表示主要基于譜圖準(zhǔn)確度得到的前十個(gè)可能結(jié)果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當(dāng)量

4. 結(jié)論

略。

文獻(xiàn)

   略

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