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　　在天然產(chǎn)物、香精香料、食品風(fēng)味分析、環(huán)境及車內(nèi)空氣分析等領(lǐng)域中，GC/MS是定性分析其中揮發(fā)性物質(zhì)的最常用、且最方便手段。在NIST、Wiley等數(shù)據(jù)庫(kù)的幫助下，我們可以輕松對(duì)GC/MS采集的未知物譜圖進(jìn)行搜庫(kù)，以確定可能的疑似物，然后再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照來(lái)最終定性。但如果質(zhì)譜譜庫(kù)或數(shù)據(jù)庫(kù)本身沒(méi)有收錄的化合物——完全未知物，那要怎么來(lái)定性確定呢？

　　傳統(tǒng)的鑒定思路是：1）使用高分辨率質(zhì)譜以獲取可能的分子式，結(jié)合EI-MS或運(yùn)行串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）得到碎片，以幫助推斷結(jié)構(gòu)。2）制備純化一定量的化合物，以便通過(guò)其他技術(shù)（核磁共振、紅外光譜等）進(jìn)行分析。3）或者購(gòu)買/ 合成可能的化合物，GC/MS進(jìn)樣后通過(guò)保留時(shí)間匹配和質(zhì)譜圖對(duì)照來(lái)確定未知物。

　　但這種傳統(tǒng)的鑒定方法過(guò)于繁瑣，而且需要使用到昂貴的高分辨質(zhì)譜儀，對(duì)于大多數(shù)只有四極桿GC/MS的用戶來(lái)說(shuō)不切實(shí)際。

　　今天我們將分享一種全新的、且更為簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的方法，它能在四極桿GC/MS上直接實(shí)現(xiàn)對(duì)”完全未知物“的結(jié)構(gòu)推測(cè)。

　　● 在MassWorks軟件中通過(guò)PFTBA標(biāo)樣校準(zhǔn)后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得精確質(zhì)量 /譜圖準(zhǔn)確度，從而得到未知物的分子式。

　　● 進(jìn)行NIST的 “Hybrid Search”，該檢索方法可查找數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在但相關(guān)的化合物，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

　　● 利用AI預(yù)測(cè)的保留指數(shù)（NIST AIRI），通過(guò)保留指數(shù)匹配進(jìn)行確認(rèn)或篩選。

GC/MS上的鑒定真正的未知物

　　如圖1所示，未知峰13.88min，峰強(qiáng)度很高，提取的質(zhì)譜圖也表現(xiàn)為單一組分的純凈質(zhì)譜圖。我們同時(shí)也采集了C9-40的正構(gòu)烷烴系列混標(biāo)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的保留指數(shù)校正，該未知峰的實(shí)測(cè)保留指數(shù)RI=3329.8。

圖1：13.88min處的未知峰及其質(zhì)譜圖（Pforile模式下采集）

　　我們將該未知峰的質(zhì)譜圖發(fā)送至NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索，如圖2所示，排名第一的候選結(jié)果，其正/反檢索匹配值分別為763和839，得到的候選結(jié)果并不理想，且各個(gè)待選結(jié)果的保留指數(shù)也與譜庫(kù)收錄的保留指數(shù)存在非常大的差異，這就表明，NIST檢索對(duì)該未知峰并不適用。

圖2：未知峰13.88min的NIST檢索結(jié)果并不理想，沒(méi)有正確的匹配

　　接下來(lái)我們將嘗試采用新方法對(duì)該未知物進(jìn)行全面的分析。

　　1. GC/MS結(jié)合MassWorks軟件測(cè)定精確分子量/分子式

　　以Profile輪廓模式采集的GC/MS數(shù)據(jù)，使用MassWorks軟件進(jìn)行校準(zhǔn)，可獲得良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度（約 ±10 mDa），與譜圖準(zhǔn)確度相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)幾 ppm 的有效質(zhì)量準(zhǔn)確度，并最終得到精確質(zhì)量和分子式。

　　該未知峰在MassWorks軟件中由PFTBA標(biāo)樣校正后得到的精確質(zhì)量為450.4816，在±20mDa的質(zhì)量偏差內(nèi)，設(shè)定元素組成為C、H、O、N，CLIPS search的分子式檢索共得到五個(gè)分子式，借助分子式同位素的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy），我們可以確定正確的分子式是第一個(gè)分子式，即C31H62O。

圖3：未知物的精確質(zhì)量測(cè)定結(jié)果和分子式測(cè)定結(jié)果（左上：分子式結(jié)果；右上：精確質(zhì)量數(shù)和C31H62O的同位素匹配度；下：未知物的質(zhì)譜圖和分子離子）

　　2. AIRI預(yù)測(cè)保留指數(shù)

　　確定分子式為C31H62O后，我們?cè)赑ubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分子式檢索，嘗試找出所有可能的結(jié)構(gòu)。利用Cerno Bioscience 公司開(kāi)發(fā)基于網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用程序，預(yù)測(cè)所有可能結(jié)構(gòu)的保留指數(shù)。

　　如圖4所示，Pumchem檢索分子式，共有57種可能的化合物，將它們的AIRI在實(shí)測(cè)RI的±30范圍進(jìn)行篩選，剩下四個(gè)可能的化合物，但還不能確定到底哪一個(gè)正確的化合物。

圖4：Pumchem檢索分子式得到的所有可能的結(jié)構(gòu)（左）；將AIRI預(yù)測(cè)的保留指數(shù)用實(shí)測(cè)值±30過(guò)濾，剩下四個(gè)可能的結(jié)構(gòu)（右）

　　3. NIST Hybrid Search得到結(jié)構(gòu)式

　　在NIST中，我們將檢索模式切換為Hybrid Search模式，它可以幫助我們檢索出跟未知物結(jié)構(gòu)相似化合物，通過(guò)這些相似化合物我們有可能推測(cè)或得到未知物的結(jié)構(gòu)式。

　　使用Hybrid Search需滿足如下條件：

　　● Hybrid Search可匹配碎片離子和中性丟失。

　　● 通過(guò)納入 “近鄰” 化合物來(lái)擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫(kù)的范圍。

　　● 需要數(shù)據(jù)庫(kù)中存在相似的化合物。

　　● 必須知道名義分子量，最好還知道分子式。

　　● 質(zhì)量差異必須局限于分子的單個(gè)區(qū)域，且分子的碎裂行為為沒(méi)有顯著變化。

　　● Delta Mass 代表數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物與未知分子之間的差異（修飾）。

圖5：Hybrid search結(jié)果示例

　　該未知峰在Hybrid Search檢索中，我們得到了三個(gè)匹配度非常高的直鏈烷酮化合物，這意味著該未知物與這三個(gè)烷酮化合物擁有著類似的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)合我們?cè)谇懊嬉呀?jīng)確定的分子式C31H62O，我們推測(cè)該未知物是跟它們有著不同C原子數(shù)量的烷酮化合物。

　　其結(jié)構(gòu)式預(yù)測(cè)如圖6左上圖所示。而這一分子式結(jié)構(gòu)剛好是Pubchem結(jié)果中剩余四個(gè)可能的待選之一。該結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)AIRI保留指數(shù)為3320，與實(shí)測(cè)保留指數(shù)3329.8的差值為9.8。

圖6：

　　綜合MassWorks測(cè)定的精確質(zhì)量/分子式、基于Pubchem分子式結(jié)構(gòu)檢索和AIRI保留指數(shù)、Hybrid Search檢索結(jié)果，我們幾乎可以確定該未知物為2-Hentriacontanone，分子式為C31H62O。

　　小結(jié)：

　　結(jié)合MassWorks軟件的精確質(zhì)量/分子式、保留指數(shù)和Hybrid Search檢索，是一種在單四極桿 GC/MS 上進(jìn)行未知物定性分析的簡(jiǎn)單、快速的方法。

　　對(duì)于不適合Hybrid Search的情況：我們?nèi)匀豢梢允褂帽Ａ糁笖?shù) + 分子式鑒定來(lái)篩選未知化合物潛的潛在候選物。

　　碎片分析也可用于驗(yàn)證鑒定結(jié)果（例如使用 NIST MS Interpreter）。

　　為了保證結(jié)果的正確性，最終的化合物鑒定還是需要通過(guò)合成化合物來(lái)進(jìn)行確證。

　　關(guān)于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開(kāi)發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們?cè)诘头直媛实乃臉O桿GC/MS、LC/MS直接測(cè)定化合物的精確質(zhì)量，并通過(guò)獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。