20_在Orbitrap上結(jié)合高分辨率的精確質(zhì)量和低分辨率的譜圖準(zhǔn)確度來確定"未知化合物"的元素組成
未知化合物的鑒定極大地受益于高分辨率(HiRes)質(zhì)譜系統(tǒng)不斷提高的質(zhì)量準(zhǔn)確度能力。不幸的是,由于各種硬件 / 固件 / 軟件因素,除了有限的情況外,唯一確定完全未知物元素組成的 “圣杯” 仍然難以實(shí)現(xiàn)。
雖然已知高分辨率質(zhì)譜能夠輕松實(shí)現(xiàn) 1-5ppm 甚至更好的質(zhì)量準(zhǔn)確度測(cè)量,但這些儀器缺乏譜圖準(zhǔn)確度(Spectral Accuracy,SA),而譜圖準(zhǔn)確度有助于進(jìn)一步排除不正確的元素組成。矛盾的是,低或較低分辨率(LowRes)質(zhì)譜雖然通常具有較低的可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量準(zhǔn)確度,但卻具有較高的譜圖準(zhǔn)確度。
在本文中,我們展示了在一次分析中利用高分辨率和低分辨率測(cè)量的可行性,通過利用現(xiàn)有 Orbitrap LC/MS 系統(tǒng)上可用的高分辨率和低分辨率掃描能力,在同一次進(jìn)樣和數(shù)據(jù)采集中實(shí)現(xiàn)獨(dú)特且高置信度的元素組成測(cè)定!
方法
1. 實(shí)驗(yàn)儀器及材料
LC/MS儀器:賽默飛 Orbitrap Exploris 480 和 Vanquish UPLC,
色譜柱: ThermoFisher Accucore C18(2.6 μm,100×2.1 mm)
樣品:Restek 31977(LC 多殘留農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 #6,有機(jī)氮化合物,100 μg/mL,乙腈),稀釋至 500 ppb。
軟件:Xcalibur 軟件(賽默飛)、MassWorks 軟件(Cerno Bioscience)
2. 實(shí)驗(yàn)條件
色譜柱:流速 0.3 mL/min,溫度 40°C。
流動(dòng)相 A:水 + 0.1% 甲酸,流動(dòng)相 B:乙腈 + 0.1% 甲酸。梯度洗脫(B 相):0-1 分鐘 1%,1-5 分鐘 25%,5-15 分鐘 60%,15.1-19 分鐘 90%,19.1-20 分鐘 1%。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集:ESI+模式
全掃描質(zhì)譜,高分辨率 120K 分辨力(RP),自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo) 1e6,50-500 Da ;
數(shù)據(jù)依賴型(DDA)全掃描 MS2:10 個(gè)離子,15K 分辨力,0.50Da 窗口,AGC 目標(biāo) 1e5 ;
全掃描質(zhì)譜,低分辨率 15K 分辨力,AGC 目標(biāo) 1e6,50-500 Da。
使用賽默飛 Xcalibur 軟件進(jìn)行后處理,使用 Cerno MassWorks 軟件進(jìn)行 sCLIPS(自校準(zhǔn)線形同位素輪廓搜索)譜圖準(zhǔn)確度分析。
結(jié)果與討論
使用 Xcalibur 軟件和精確質(zhì)量提取離子色譜圖(XIC),在采集的運(yùn)行數(shù)據(jù)中確認(rèn)了 28 種預(yù)期化合物中的 26 種,其預(yù)期保留時(shí)間(RT)位置已確定,如表1總結(jié)及其他分析結(jié)果所示。
表1:28種化合物的分析結(jié)果
120K 和 15K 分辨率下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差
在每個(gè)確定的保留時(shí)間窗口內(nèi),使用 120K 和 15K 分辨力下最多 3 個(gè)最豐富的全掃描質(zhì)譜來報(bào)告每個(gè)分辨力下的精確單同位素質(zhì)量值,將每個(gè)平均精確質(zhì)量與理論精確質(zhì)量進(jìn)行比較,計(jì)算質(zhì)量誤差(偏差)以及每個(gè)分辨力下的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差,如圖1和圖2所示。
圖1:在 120K 分辨力下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差
在 120K 分辨力下,所有質(zhì)量誤差均為正值且 < 0.6 mDa(除了錯(cuò)誤識(shí)別的化合物 #13),而標(biāo)準(zhǔn)偏差小 2-3 倍或 < 0.2mDa,這表明在 120K 分辨力下系統(tǒng)質(zhì)量誤差占主導(dǎo)地位,除非不可能,否則進(jìn)一步改進(jìn)的可能性不大。盡管如此,這使得在狹窄的 1mDa 質(zhì)量窗口內(nèi)搜索未知元素組成成為可能,但僅憑這一點(diǎn)甚至不足以接近唯一鑒定,26 種檢測(cè)到的化合物的候選分子式的平均個(gè)數(shù)為 86。
圖2:在15K 分辨力下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差
在 15K 分辨力下,質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差均增加,并且由于標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,現(xiàn)在出現(xiàn)了負(fù)質(zhì)量誤差。在 15K 分辨力下,使用狹窄的 1mDa 質(zhì)量窗口進(jìn)行可靠的未知元素組成搜索是不可行的。幸運(yùn)的是,有更準(zhǔn)確的 120K 分辨力質(zhì)量測(cè)量可用,可以取而代之。
120K 和 15K 分辨率下的譜圖準(zhǔn)確度
如表1的所示的結(jié)果中,120K分辨率下產(chǎn)生的同位素譜圖準(zhǔn)確度要明顯差于15K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度,因此導(dǎo)致了在鑒定一些化合物的分子式時(shí)的排序不佳,如化合物2,120K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度為96.3%,分子式在940個(gè)后選中排第三,而15K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度提升至98.4%,分子式排序也提升至第一位。
譜圖準(zhǔn)確度對(duì)正確分子式的鑒定能力
為了將這些測(cè)試化學(xué)品視為真正的未知有機(jī)化合物,設(shè)計(jì)了一個(gè)寬松的元素組成搜索條件,包括所有合理預(yù)期的元素,并使用關(guān)于每種元素可能的原子數(shù)及其比例的最廣泛經(jīng)驗(yàn)規(guī)則,如2表所示。
表2:sClPS檢索條件圖片
在MassWorks軟件的sCLIPS檢索分析結(jié)果中,對(duì)于每種檢測(cè)到的化合物,從 120K 和 15K 分辨力中選擇最豐富的掃描用于 sCLIPS 元素組成測(cè)定。對(duì)于 120K 掃描,使用其自身的精確質(zhì)量,而對(duì)于15K 掃描,采用 120K 掃描的精確質(zhì)量來搜索所有可能的元素組成,并按譜圖準(zhǔn)確度從高到低對(duì)列表進(jìn)行排序。
如圖3所示,化合物22號(hào)的精確質(zhì)量值m/z 284.0719采用120K分辨率質(zhì)譜圖測(cè)定,同位素的譜圖準(zhǔn)確度98.5%由15K分辨率的質(zhì)譜圖測(cè)定,根據(jù)譜圖準(zhǔn)確度,正確的分子式在全部的82個(gè)候選結(jié)果中排名第一。
圖3:化合物22的精確質(zhì)量測(cè)定(120K)和譜圖準(zhǔn)確度測(cè)定(15K)結(jié)果
如表1所示,正確化合物的譜圖準(zhǔn)確度、其在所有候選分子式中的排名以及與下一個(gè)最佳譜圖準(zhǔn)確度命中的譜圖準(zhǔn)確度差值(SA breakout)均總結(jié)在表中。當(dāng)正確化合物不是最高命中時(shí),SA breakout 計(jì)算為正確化合物與最高命中化合物的譜圖準(zhǔn)確度差值(負(fù)值)。對(duì)于所有化合物,從 120K 到 15K 分辨力掃描,譜圖準(zhǔn)確度本身(中位數(shù) 97.4% vs 98.9%)和 / 或 SA breakout(中位數(shù) 0.4% vs 1.6%)均顯著增加,從而在提高排名的同時(shí)增加了鑒定置信度。1.0% 的SA breakout 通常意味著唯一鑒定和模糊鑒定之間的區(qū)別,因此非常重要。
圖4:化合物14在120K和15K分辨率下的譜圖準(zhǔn)確度對(duì)比及分子式排名對(duì)比
以此為基準(zhǔn),在之前的嘗試中,我們使用相同的非靶向方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,并使用 GNPS 分析了一組類似的化合物,其僅正確鑒定了 75% 的測(cè)試化合物。
結(jié)論
如先前發(fā)表的文獻(xiàn)(參考文獻(xiàn)2)所述,即使優(yōu)于 1mDa 的質(zhì)量準(zhǔn)確度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以確定真實(shí)未知物的元素組成,在此次測(cè)試的 26 種檢測(cè)化合物中,平均的候選分子式個(gè)數(shù)為 86。
譜圖準(zhǔn)確度(SA)可以在質(zhì)量準(zhǔn)確度之外顯著改善元素組成,在 120K 分辨力(RP)下,26 種化合物中有 23 種在最高 SA 命中中被發(fā)現(xiàn),這與僅使用質(zhì)量準(zhǔn)確度相比是一項(xiàng)壯舉。
通過使用 120K 和 15K 分辨力掃描獲得了最顯著的結(jié)果,其中所有 26 種化合物的分子式全部被排序在候選結(jié)果中的第一位,而且由于 SA 和 SA breakout 的增加,置信度顯著提高,在商用質(zhì)譜儀上,在相同的一般數(shù)據(jù)采集條件下,通過單次進(jìn)樣 LC/MS 分析,在色譜時(shí)間尺度上實(shí)現(xiàn)了真實(shí)未知物的獨(dú)特元素組成測(cè)定。
參考文獻(xiàn):
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2. Erve,J.etal,JAMSocMassSpectrom., 2009, 20,2058-2069
3. Khodjaniyazova, S. et al, Anal. Chem. 2018, 90, 1897?1906
4. Strife, R. et al, J Mass Spectrom., 2018, 53, 921–926
5. Kind, T. et al, BMC Bioinformatics, 2007, 8:105
關(guān)于綠綿科技
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