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　　未知化合物的鑒定極大地受益于高分辨率（HiRes）質(zhì)譜系統(tǒng)不斷提高的質(zhì)量準(zhǔn)確度能力。不幸的是，由于各種硬件 / 固件 / 軟件因素，除了有限的情況外，唯一確定完全未知物元素組成的 “圣杯” 仍然難以實(shí)現(xiàn)。

　　雖然已知高分辨率質(zhì)譜能夠輕松實(shí)現(xiàn) 1-5ppm 甚至更好的質(zhì)量準(zhǔn)確度測(cè)量，但這些儀器缺乏譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy，SA），而譜圖準(zhǔn)確度有助于進(jìn)一步排除不正確的元素組成。矛盾的是，低或較低分辨率（LowRes）質(zhì)譜雖然通常具有較低的可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量準(zhǔn)確度，但卻具有較高的譜圖準(zhǔn)確度。

　　在本文中，我們展示了在一次分析中利用高分辨率和低分辨率測(cè)量的可行性，通過利用現(xiàn)有 Orbitrap LC/MS 系統(tǒng)上可用的高分辨率和低分辨率掃描能力，在同一次進(jìn)樣和數(shù)據(jù)采集中實(shí)現(xiàn)獨(dú)特且高置信度的元素組成測(cè)定！

方法

　　1. 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

　　LC/MS儀器：賽默飛 Orbitrap Exploris 480 和 Vanquish UPLC，

　　色譜柱： ThermoFisher Accucore C18（2.6 μm，100×2.1 mm）

　　樣品：Restek 31977（LC 多殘留農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 #6，有機(jī)氮化合物，100 μg/mL，乙腈），稀釋至 500 ppb。

　　軟件：Xcalibur 軟件（賽默飛）、MassWorks 軟件（Cerno Bioscience）

　　2. 實(shí)驗(yàn)條件

　　色譜柱：流速 0.3 mL/min，溫度 40°C。

　　流動(dòng)相 A：水 + 0.1% 甲酸，流動(dòng)相 B：乙腈 + 0.1% 甲酸。梯度洗脫（B 相）：0-1 分鐘 1%，1-5 分鐘 25%，5-15 分鐘 60%，15.1-19 分鐘 90%，19.1-20 分鐘 1%。

　　質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集：ESI+模式

　　全掃描質(zhì)譜，高分辨率 120K 分辨力（RP），自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo) 1e6，50-500 Da ；

　　數(shù)據(jù)依賴型（DDA）全掃描 MS2：10 個(gè)離子，15K 分辨力，0.50Da 窗口，AGC 目標(biāo) 1e5 ；

　　全掃描質(zhì)譜，低分辨率 15K 分辨力，AGC 目標(biāo) 1e6，50-500 Da。

　　使用賽默飛 Xcalibur 軟件進(jìn)行后處理，使用 Cerno MassWorks 軟件進(jìn)行 sCLIPS（自校準(zhǔn)線形同位素輪廓搜索）譜圖準(zhǔn)確度分析。

結(jié)果與討論

　　使用 Xcalibur 軟件和精確質(zhì)量提取離子色譜圖（XIC），在采集的運(yùn)行數(shù)據(jù)中確認(rèn)了 28 種預(yù)期化合物中的 26 種，其預(yù)期保留時(shí)間（RT）位置已確定，如表1總結(jié)及其他分析結(jié)果所示。

表1：28種化合物的分析結(jié)果

　　120K 和 15K 分辨率下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差

　　在每個(gè)確定的保留時(shí)間窗口內(nèi)，使用 120K 和 15K 分辨力下最多 3 個(gè)最豐富的全掃描質(zhì)譜來報(bào)告每個(gè)分辨力下的精確單同位素質(zhì)量值，將每個(gè)平均精確質(zhì)量與理論精確質(zhì)量進(jìn)行比較，計(jì)算質(zhì)量誤差（偏差）以及每個(gè)分辨力下的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差，如圖1和圖2所示。

圖1：在 120K 分辨力下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差

　　在 120K 分辨力下，所有質(zhì)量誤差均為正值且 < 0.6 mDa（除了錯(cuò)誤識(shí)別的化合物 #13），而標(biāo)準(zhǔn)偏差小 2-3 倍或 < 0.2mDa，這表明在 120K 分辨力下系統(tǒng)質(zhì)量誤差占主導(dǎo)地位，除非不可能，否則進(jìn)一步改進(jìn)的可能性不大。盡管如此，這使得在狹窄的 1mDa 質(zhì)量窗口內(nèi)搜索未知元素組成成為可能，但僅憑這一點(diǎn)甚至不足以接近唯一鑒定，26 種檢測(cè)到的化合物的候選分子式的平均個(gè)數(shù)為 86。

圖2：在15K 分辨力下的質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差

　　在 15K 分辨力下，質(zhì)量誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差均增加，并且由于標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，現(xiàn)在出現(xiàn)了負(fù)質(zhì)量誤差。在 15K 分辨力下，使用狹窄的 1mDa 質(zhì)量窗口進(jìn)行可靠的未知元素組成搜索是不可行的。幸運(yùn)的是，有更準(zhǔn)確的 120K 分辨力質(zhì)量測(cè)量可用，可以取而代之。

　　120K 和 15K 分辨率下的譜圖準(zhǔn)確度

　　如表1的所示的結(jié)果中，120K分辨率下產(chǎn)生的同位素譜圖準(zhǔn)確度要明顯差于15K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度，因此導(dǎo)致了在鑒定一些化合物的分子式時(shí)的排序不佳，如化合物2，120K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度為96.3%，分子式在940個(gè)后選中排第三，而15K分辨率的譜圖準(zhǔn)確度提升至98.4%，分子式排序也提升至第一位。

　　譜圖準(zhǔn)確度對(duì)正確分子式的鑒定能力

　　為了將這些測(cè)試化學(xué)品視為真正的未知有機(jī)化合物，設(shè)計(jì)了一個(gè)寬松的元素組成搜索條件，包括所有合理預(yù)期的元素，并使用關(guān)于每種元素可能的原子數(shù)及其比例的最廣泛經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，如2表所示。

表2：sClPS檢索條件圖片

　　在MassWorks軟件的sCLIPS檢索分析結(jié)果中，對(duì)于每種檢測(cè)到的化合物，從 120K 和 15K 分辨力中選擇最豐富的掃描用于 sCLIPS 元素組成測(cè)定。對(duì)于 120K 掃描，使用其自身的精確質(zhì)量，而對(duì)于15K 掃描，采用 120K 掃描的精確質(zhì)量來搜索所有可能的元素組成，并按譜圖準(zhǔn)確度從高到低對(duì)列表進(jìn)行排序。

　　如圖3所示，化合物22號(hào)的精確質(zhì)量值m/z 284.0719采用120K分辨率質(zhì)譜圖測(cè)定，同位素的譜圖準(zhǔn)確度98.5%由15K分辨率的質(zhì)譜圖測(cè)定，根據(jù)譜圖準(zhǔn)確度，正確的分子式在全部的82個(gè)候選結(jié)果中排名第一。

圖3：化合物22的精確質(zhì)量測(cè)定（120K）和譜圖準(zhǔn)確度測(cè)定（15K）結(jié)果

　　如表1所示，正確化合物的譜圖準(zhǔn)確度、其在所有候選分子式中的排名以及與下一個(gè)最佳譜圖準(zhǔn)確度命中的譜圖準(zhǔn)確度差值（SA breakout）均總結(jié)在表中。當(dāng)正確化合物不是最高命中時(shí)，SA breakout 計(jì)算為正確化合物與最高命中化合物的譜圖準(zhǔn)確度差值（負(fù)值）。對(duì)于所有化合物，從 120K 到 15K 分辨力掃描，譜圖準(zhǔn)確度本身（中位數(shù) 97.4% vs 98.9%）和 / 或 SA breakout（中位數(shù) 0.4% vs 1.6%）均顯著增加，從而在提高排名的同時(shí)增加了鑒定置信度。1.0% 的SA breakout 通常意味著唯一鑒定和模糊鑒定之間的區(qū)別，因此非常重要。

圖4：化合物14在120K和15K分辨率下的譜圖準(zhǔn)確度對(duì)比及分子式排名對(duì)比

　　以此為基準(zhǔn)，在之前的嘗試中，我們使用相同的非靶向方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并使用 GNPS 分析了一組類似的化合物，其僅正確鑒定了 75% 的測(cè)試化合物。

結(jié)論

　　如先前發(fā)表的文獻(xiàn)（參考文獻(xiàn)2）所述，即使優(yōu)于 1mDa 的質(zhì)量準(zhǔn)確度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以確定真實(shí)未知物的元素組成，在此次測(cè)試的 26 種檢測(cè)化合物中，平均的候選分子式個(gè)數(shù)為 86。

　　譜圖準(zhǔn)確度（SA）可以在質(zhì)量準(zhǔn)確度之外顯著改善元素組成，在 120K 分辨力（RP）下，26 種化合物中有 23 種在最高 SA 命中中被發(fā)現(xiàn)，這與僅使用質(zhì)量準(zhǔn)確度相比是一項(xiàng)壯舉。

　　通過使用 120K 和 15K 分辨力掃描獲得了最顯著的結(jié)果，其中所有 26 種化合物的分子式全部被排序在候選結(jié)果中的第一位，而且由于 SA 和 SA breakout 的增加，置信度顯著提高，在商用質(zhì)譜儀上，在相同的一般數(shù)據(jù)采集條件下，通過單次進(jìn)樣 LC/MS 分析，在色譜時(shí)間尺度上實(shí)現(xiàn)了真實(shí)未知物的獨(dú)特元素組成測(cè)定。

　　參考文獻(xiàn)：

　　1.Wang, Y et al, Anal. Chem., 2010, 82, 7055-7062(17)

　　2. Erve,J.etal,JAMSocMassSpectrom., 2009, 20,2058-2069

　　3. Khodjaniyazova, S. et al, Anal. Chem. 2018, 90, 1897?1906

　　4. Strife, R. et al, J Mass Spectrom., 2018, 53, 921–926

　　5. Kind, T. et al, BMC Bioinformatics, 2007, 8:105