危機(jī)環(huán)境和本土安全事件中利用快速響應(yīng)GC/MS流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室提高未知物識(shí)別的確認(rèn)能力
引言
康涅狄格環(huán)境保護(hù)局(CT DEP)位于康涅狄格州的Windsor,，是裝備GC/MS等分析儀器的流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室，負(fù)責(zé)本土安全和應(yīng)急環(huán)境事件的現(xiàn)場(chǎng),、快速未知化合物的測(cè)定,。CT DEP應(yīng)急響應(yīng)隊(duì)員24/7待命,，通常是救火隊(duì)員、地方或聯(lián)邦執(zhí)法人員遇到不明的可能化學(xué)危險(xiǎn)物時(shí)電話求助,，他們的責(zé)任是快速識(shí)別這些物質(zhì),，以便事故指揮官和執(zhí)法人員作出適當(dāng)?shù)膽?yīng)變措施，在這種情況下,，快速準(zhǔn)確識(shí)別至關(guān)重要,，因?yàn)檫@有助于迅速?zèng)Q定是對(duì)無毒物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單控制處理還是撤離周圍居民。
GC/MS是快速識(shí)別揮發(fā)和半揮發(fā)有機(jī)物的選擇工具,，標(biāo)準(zhǔn)EPA方法能識(shí)別超過200種環(huán)境相關(guān)的化合物,，這些方法具有很好的靈敏度，根據(jù)保留時(shí)間和GC/MS譜圖檢索可以準(zhǔn)確識(shí)別這些目標(biāo)化合物,。然而,，對(duì)于不能用這些方法表征的化合物，僅僅利用GC/MS譜庫檢索會(huì)產(chǎn)生很大的不確定性,。錯(cuò)誤識(shí)別對(duì)于先遣急救員和執(zhí)法者，可能導(dǎo)致昂貴的,、危險(xiǎn)的甚至致命的錯(cuò)誤響應(yīng),，確認(rèn)識(shí)別的不確定性或延遲也能導(dǎo)致公共資源的極大浪費(fèi)。
為了提高未知物正確識(shí)別的可能性,，需要一些分析方法進(jìn)行二次確證分析,，如GC/MS譜庫匹配后接下來利用質(zhì)量GC/MS進(jìn)行分子式確證。對(duì)于化學(xué)物識(shí)別的初期應(yīng)答者,，挑戰(zhàn)是非常嚴(yán)峻的,，因?yàn)榉治霰仨毦哂懈叨鹊目尚哦龋仨毧焖?通常在1- 3小時(shí)內(nèi)),，而且必須依靠流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室中已有的分析儀器,。對(duì)這些應(yīng)用，對(duì)于GC/MS結(jié)果的確信和準(zhǔn)確性需要額外的確證工具,。
在質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理上的進(jìn)步,，對(duì)于在單位分辨質(zhì)譜上實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的分子式識(shí)別顯示了巨大的潛力[1]。該應(yīng)用基于質(zhì)量數(shù)和線形校正的新技術(shù),，在單位分辨質(zhì)譜上得到質(zhì)量數(shù)和的同位素峰形匹配(光譜準(zhǔn)確度)用于分子式識(shí)別,，得到的結(jié)果與高分辨測(cè)量?jī)x器具有很好的可比性。
本文呈現(xiàn)一個(gè)新方法,，通過標(biāo)準(zhǔn)GC/MS譜庫檢索,，并結(jié)合在標(biāo)準(zhǔn)單位質(zhì)量分辨四極桿GC/MS儀器的分子式識(shí)別進(jìn)行結(jié)果確認(rèn)，提高GC/MS對(duì)未知物識(shí)別的速度和準(zhǔn)確性,。方法是基于VOC分析的標(biāo)準(zhǔn)EPA方法[2](EPA 8260B),，這里定義為EVOCA(擴(kuò)展的VOC分析),。
實(shí)驗(yàn)
使用標(biāo)準(zhǔn)EPA 8260B方法中7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)替代化合物和內(nèi)標(biāo)，建立用于評(píng)價(jià)EVOCA的測(cè)試方案,，該測(cè)試方案使用73個(gè)與環(huán)境相關(guān)的目標(biāo)化合物,，在另一個(gè)單獨(dú)運(yùn)行中有額外17個(gè)化合物，所以共有90個(gè)化合物用于評(píng)價(jià)該方法,。
73個(gè)目標(biāo)化合物測(cè)試混合物溶解在10 ml水中,，每種組分的濃度約為20 ug/l，通過吹掃捕集系統(tǒng)和50: 1的分流,，每種大約4 ng的組分被引入質(zhì)譜系統(tǒng),。17種額外化合物制成約2000 ug/ml的濃度，進(jìn)樣1 ul并通過相同比例的分流,，每種約40 ng的組分引入質(zhì)譜系統(tǒng),。
Agilent 6890-5973 GC/MS系統(tǒng)安裝在CT DEP流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室用于全部分析。分析使用標(biāo)準(zhǔn)EPA 8260B方法,，除了MS被設(shè)定為Agilent的"raw“模式(原始數(shù)據(jù)模式)采集譜圖數(shù)據(jù),，原始采集模式采集和保存的MS數(shù)據(jù)是連續(xù)的，這點(diǎn)對(duì)于分子式識(shí)別的譜圖校正是必要的,。利用Agilent Chemstation軟件對(duì)每種目標(biāo)測(cè)試化合物在NIST 02譜庫中進(jìn)行譜圖檢索,，并列出排在前面的檢索結(jié)果。圖1顯示了73個(gè)目標(biāo)化合物運(yùn)行的色譜圖和一個(gè)感興趣化合物離子分析結(jié)果,。額外的17種VOCs在獨(dú)立的運(yùn)行中使用同樣方法進(jìn)行分析,，僅僅是樣品引入方式不同。
圖1. 頂圖顯示73種目標(biāo)EPA化合物的總離子流圖,。底圖顯示n-丁苯未校正(紅色)和校正后及理論(綠和黑色)譜圖的匹配結(jié)果,，99.85%的光譜準(zhǔn)確度匹配幾乎完全重疊
每次運(yùn)行后數(shù)據(jù)被裝載進(jìn)MassWorks軟件(Cerno Bioscience, Danbury, CT) ，利用表1中列出替代化合物和內(nèi)標(biāo)的六個(gè)選擇離子校正質(zhì)譜數(shù)據(jù),，得到質(zhì)量數(shù)和線形譜圖,，選擇的校正離子質(zhì)量涵蓋了整個(gè)感興趣的質(zhì)量范圍，提供了全面的譜圖校正信息,。校正然后應(yīng)用在整個(gè)運(yùn)行測(cè)試上,，并對(duì)73種EPA目標(biāo)化合物和17個(gè)額外VOCs中每種化合物譜圖進(jìn)行平均。表2顯示了73種目標(biāo)物中的部分化合物,。根據(jù)全部分析結(jié)果的質(zhì)量信息,，利用每個(gè)化合物的單一同位素峰位大20 mDa質(zhì)量偏差，對(duì)感興趣的離子進(jìn)行分子式檢索,。既然,，方法代表真正未知物分析，設(shè)定未知物的元素組成為C、H,、N,、O、F,、Br,、Cl、S和P進(jìn)行檢索,，這些也是影響環(huán)境和健康的相關(guān)化學(xué)品中常見元素,。一旦分子式列表產(chǎn)生，MassWorks校正線形譜圖同位素輪廓搜索(CLIPS)的分子式檢索功能被應(yīng)用到選擇離子,，并根據(jù)譜圖準(zhǔn)確度列出可能分子式列表,。譜圖準(zhǔn)確度是測(cè)量校正的線形譜圖與每個(gè)候選分子式理論計(jì)算譜圖匹配程度的指標(biāo)：
譜圖準(zhǔn)確度(Spectral Accuracy) = (1- |RMSE| ) * 100
這里RMSE是校正譜圖與理論譜圖誤差的均方根，因此數(shù)據(jù)100是符合,，圖2說明了匹配的例子,。得到的分子式結(jié)果然后利用譜庫檢索進(jìn)行確認(rèn)，以驗(yàn)證混合物測(cè)試的可靠性,。
表1. 用于質(zhì)譜校正的離子和校正誤差
圖2. CLIPS檢索后n-丁苯譜圖匹配結(jié)果,。頂部顯示譜圖準(zhǔn)確度為99.85%排名的校正譜圖(紅色)與理論譜圖(黑色)的疊加圖；底部顯示譜圖準(zhǔn)確度為97.53%排名第二(C7H15OF)匹配圖 表2. 94種目標(biāo)VOCs中的部分化合物 結(jié)果和討論 對(duì)于大部分化合物,，通過NIST譜庫匹配,，分子離子用于確定元素組成，但在某些情況下分子離子非常弱或沒有分子離子峰,，在這種情況下，可以用一個(gè)或更多的碎片離子用于確證正確的分子式,。73種目標(biāo)化合物和17種額外VOCs質(zhì)量準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為13 mDa和7 mDa,，保守設(shè)定大20 mDa的質(zhì)量窗口用于元素組成搜索，由于設(shè)定的元素組成搜索范圍很寬,，雖然通常有50-100待選化合物,，但對(duì)于更高分子量的化合物可能會(huì)得到更多的待選化合物。即使在高分辨GC-TOF儀器,，理想條件下的5 ppm[3]質(zhì)量精度,，利用這些限制元素組成搜索時(shí)也會(huì)得到約20種待選分子式，而對(duì)于“真實(shí)樣品”分析,，質(zhì)量準(zhǔn)確度可能低2- 4倍,。這說明通過同位素峰形進(jìn)一步限制待選分子式數(shù)量對(duì)于得到更可靠的分析結(jié)果是非常重要的。 圖2說明了使用CLIPS的同位素峰形匹配,。譜圖校正不但校正了線形譜圖也校正了質(zhì)量軸位置,，利用列表中分子式計(jì)算出的理論譜圖與測(cè)量譜圖進(jìn)行準(zhǔn)確對(duì)比，不但計(jì)算出譜圖準(zhǔn)確度值，而且可以看到同位素輪廓比較圖,，驗(yàn)證其匹配程度,。對(duì)于NIST或其它譜庫中不存在的真正未知物，對(duì)其進(jìn)行分析也是可能的,，在這種情況下,，該方法至少能提供未知物的化學(xué)組成信息，結(jié)合化學(xué)及其它線索幫助識(shí)別化合物,。 表3顯示了結(jié)果總結(jié),。值得注意的是，對(duì)于每個(gè)測(cè)試的化合物,，得到的有用分子式信息用于譜庫檢索結(jié)果的確證,。壞的情況，苯乙烯(C8H8, MW=104.0626 Da )的分子離子(名義質(zhì)量為m/z 104 Da)用于化合物識(shí)別,，譜圖準(zhǔn)確度排名第五,，進(jìn)一步研究表明，二甲苯與苯乙烯是共流出物,，它也在m/z 104 Da產(chǎn)生M-H2的干擾碎片離子,，苯乙烯分子離子的譜圖準(zhǔn)確度為89.3%，遠(yuǎn)低于觀察的大部分離子的98%典型值及更好的99%,。低譜圖準(zhǔn)確度對(duì)于不正確化合物識(shí)別是很好的指示,，而質(zhì)量準(zhǔn)確度做不到這點(diǎn)。干擾現(xiàn)象很容易通過對(duì)比測(cè)量譜圖和理論譜圖進(jìn)行證實(shí)(如圖3),，明顯看到不好的匹配結(jié)果,，可以猜測(cè)是干擾造成的。當(dāng)仔細(xì)研究和檢查色譜峰后,，猜測(cè)二甲苯是一個(gè)共流出物,，為了證實(shí)這點(diǎn)，將二甲苯的分子離子和它的M-H離子包含進(jìn)來重新進(jìn)行CLIPS搜索,，搜索自動(dòng)計(jì)算這三個(gè)離子的好匹配,，得到99.75%更好譜圖準(zhǔn)確度，因此可以確認(rèn)差的譜圖準(zhǔn)確度是干擾造成的,。 表3. 全部化合物的測(cè)試結(jié)果總結(jié),。根據(jù)譜圖準(zhǔn)確度排名，90個(gè)化合物中除了4個(gè)外正確離子都排在前兩位 該方法的優(yōu)點(diǎn)是完全以現(xiàn)存的分析方法基礎(chǔ),，使用替代化合物和內(nèi)標(biāo),，不需要額外的譜圖校正標(biāo)樣如PFTBA，因此對(duì)現(xiàn)存的分析方法不需改變,。這簡(jiǎn)化了分析過程且改進(jìn)了譜圖校正,，僅需要額外的數(shù)據(jù)分析步驟就得到分子式結(jié)果,，這意味該方法很容易適合其它實(shí)驗(yàn)室。 將CLIPS搜索應(yīng)用到多個(gè)離子碎片,，很容易在GC/MS上進(jìn)一步提高分子式識(shí)別的確證程度(見表4),，因?yàn)樗槠x子的組成元素一定來源于其分子離子。這里,，對(duì)我們有利的事實(shí)是EI離子化提供了豐富的化學(xué)信息,，利用這個(gè)相同的方法，我們可以解決NIST譜庫檢索中分子離子峰很弱或沒有的情況,。在完全未知物時(shí),，碎片丟失也能給出結(jié)構(gòu)線索。通過識(shí)別不相關(guān)分子和碎片離子,，這些信息也能用于幫助識(shí)別化合物是共流出物,。 圖3. 頂圖顯示m/z 104苯乙烯離子(C8H8, 紅色)與其理論譜圖(黑色)疊加圖，匹配結(jié)果很差,，暗示有干擾離子存在,。底圖為包含了二甲苯(C8H10)和脫氫的二甲苯的匹配圖，混合物匹配的譜圖準(zhǔn)確度為99.75%,，確認(rèn)存在二甲苯干擾,。 表4. 甲基丙烯酸乙酯兩個(gè)碎片離子的CLIPS檢索結(jié)果。正確的分子離子排在第二位,，通過分析另一個(gè)m/z 69離子,，正確的分子式能夠根據(jù)m/z 69 碎片(C4H5O)丟失C2H5O推斷出來 結(jié)論 表3說明的90個(gè)測(cè)試化合物中，81個(gè)化合物確證的分子式在CLIPS檢索列表中排在位,，5個(gè)化合物排在列表的第二位,，總共超過95%化合物具有很高的確證效率，其余的四個(gè)化合物排在3-5的位置,，該結(jié)果清楚表明,，通過這個(gè)方法得到的譜圖準(zhǔn)確度和質(zhì)量精度對(duì)于GC/MS譜庫檢索提供了高度可靠的確證。這個(gè)方法關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于,，能夠運(yùn)行在成本較低的流動(dòng)GC/MS儀器，通?？捎糜趥€(gè)人負(fù)責(zé)的初始響應(yīng)形式,，這個(gè)額外確認(rèn)能力在緊急時(shí)刻甚至生命危機(jī)時(shí)刻是非常關(guān)鍵的。 同樣方法也很容易擴(kuò)展到其它應(yīng)用領(lǐng)域,，GC/MS系統(tǒng)對(duì)未知半揮發(fā)有機(jī)化合物(SVOCs)進(jìn)行快速識(shí)別,，包括香精香料、藥物降解,、天然產(chǎn)物識(shí)別和污染等等,。這種方式結(jié)合化學(xué)離子化GC/MS對(duì)于未知化合物結(jié)構(gòu)解析提供額外的有價(jià)值信息。 參考文獻(xiàn) [1] Gu, Ming, et al “Accurate mass filtering of ion chromatograms for metabolite identification using a unit mass resolution liquid chromatography/mass spectrometry system”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006; 20: 764–770. [2] EPA METHOD 8260B VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS BY GAS CHROMATOGRAPHY/MASS SPECTROMETRY (GC/MS) (see www.epa.gov) [3] Manufacturers published specification for the Waters GCT Premier. Waters Corporation, Milford, MA. [4] Kind, T. et al “Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm”, BMC Bioinformatics 2006, 7, 234 (www.biomedcentral.com/1471-2105/7/234). [5] S.E. Stein and D.R. Scott, “Optimization and testing of mass spectral search algorithms for compound identification”, J. Am. Soc. Mass Spectrom 5 (1994), pp. 859–866.
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