質(zhì)譜上準(zhǔn)確鑒定未知化合物究竟需要達(dá)到多少的質(zhì)量精度,？50、5,、還是1ppm,？
質(zhì)譜的質(zhì)量精度是衡量質(zhì)譜定性能力的一個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)前常見的高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（TOF,、Orbitrap）的質(zhì)量精度為通常在1-5ppm之間,，但我們很難通過測定的精確質(zhì)量數(shù)得到未知物的唯一分子式，特別是對于m/z > 400的化合物,。
如圖1所示,，即使質(zhì)量精度達(dá)到FT-MS的0.1 ppm以內(nèi)，隨著分子量的增大,，分子式的可能性越來越多,。因此，僅靠質(zhì)譜的高質(zhì)量精度,，往往并不能確定一個(gè)唯一的分子式,，尤其是當(dāng)要考慮到更多的元素種類時(shí)。
圖1：不同質(zhì)量精度下的元素組成個(gè)數(shù)
（數(shù)據(jù)來源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）
質(zhì)譜上測定一個(gè)化合物時(shí)得到的信息不只是單同位素峰的精確質(zhì)量,，還包括了它的重同位素峰及其相對分布,。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中已經(jīng)證明了同位素比例結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)在減少可能的元素組成方面比單純依靠更高的分辨率和質(zhì)量精度更占優(yōu)勢。在下文中,，我們將在高分辨率(TOF或Orbitrap)和傳統(tǒng)的單或三重四極質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，介紹和質(zhì)量精度和同位素譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）相結(jié)合對未知物分子式鑒定的作用。
四極桿質(zhì)譜上的未知物的分子式測定
在MassWorks軟件中借助TrueCal?校正技術(shù),，可以將四極桿質(zhì)譜的質(zhì)量精度提高100倍以上,，將質(zhì)量精度從0.x提升至0.00x的質(zhì)量精度,。結(jié)合在校正過程獲得的無與倫比的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）,，通過CLIPS檢索分析，就可以在四極桿GC/MS或LC/MS上來獲得鑒定未知化合物的分子式的能力,。我們對LC/MS測定的C25H23N2OS+進(jìn)行了分析,，MassWorks軟件測定的精確質(zhì)量數(shù)m/z = 399.1448，圖2顯示CLIPS檢索分析的條件,，設(shè)定可能元素組成為C,、H、N,、O,、S,，檢索的質(zhì)量誤差為 ±20mDa。
圖2：CLIPS檢索條件
圖3顯示了CLIPS檢索分析的結(jié)果,，列表中一共有126個(gè)可能的候選分子式,。當(dāng)我們用同位素的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）進(jìn)行排序時(shí)，譜圖準(zhǔn)確度≥98.5%的候選分子式只有5個(gè),，正確的分子式C25H23N2OS被準(zhǔn)確地顯示在了列表中的第1位,。
圖3：C25H23N2OS的CLIPS分子式檢索結(jié)果（按譜圖準(zhǔn)確度從高至低排序）
正確分子式C25H23N2OS的譜圖準(zhǔn)確度為99.1%，圖4（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對比,，兩者完美重合,。圖4（下）顯示了排名第1、5,、6位分子式的理論譜圖的對比,，可以看到，由于C原子個(gè)數(shù)的不同,，在重同位素A+1處,，存在明顯的豐度差異，譜圖準(zhǔn)確度越高,，分子式正確的可能越高,。因此譜圖準(zhǔn)確度是幫我們識別正確分子式的一個(gè)重要指標(biāo)。
圖4：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較,；（下）排序1,、5、6位分子式的理論同位素分布比較
如果只考慮質(zhì)量精度,，我們需要達(dá)到多少的精度才能幫助我們?nèi)フ业侥繕?biāo)分子式呢,？我們假設(shè)了理論的精確質(zhì)量為實(shí)測值，重新進(jìn)行了CLIPS分子式檢索,，并將分子式的排序設(shè)定為按質(zhì)量誤差排序,，結(jié)果見圖5。在得到的119個(gè)待選結(jié)果中,，至少需要質(zhì)量精度優(yōu)于1.5ppm才能在前5個(gè)候選分子式中找到正確的分子式,。
圖5：C25H23N2OS的分子式檢索結(jié)果（按質(zhì)量誤差從小到大排序）
高分辨質(zhì)譜TOF的未知物的分子式測定
在MassWorks軟件中通過sCLIPS檢索分析，可以對TOF數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的峰形校正以獲得高的譜圖準(zhǔn)確度,。圖6顯示了C43H74NO15的質(zhì)譜圖校正前后的對比,。
圖6：化合物C43H74NO15的TOF數(shù)據(jù)校正前后的比較
圖7為sCLIPS檢索分析時(shí)設(shè)定的檢索參數(shù)，設(shè)定可能元素組成為C,、H,、N、O、S,，檢索的質(zhì)量誤差為 ±5ppm,。
圖7：sCLIPS檢索條件
圖8顯示了sCLIPS檢索分析的結(jié)果，列表中一共有63個(gè)可能的候選分子式,。當(dāng)我們用同位素的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）進(jìn)行排序時(shí),，分別只有3個(gè)或2個(gè)候選分子式的譜圖準(zhǔn)確度≥98%或98.5%，正確的分子式C43H74NO15被準(zhǔn)確地顯示在了列表中的第1位,。
圖8：C43H74NO15的sCLIPS分子式檢索結(jié)果（按譜圖準(zhǔn)確度從高至低排序）
正確分子式C43H74NO15的譜圖準(zhǔn)確度為98.97%,，圖9（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對比，兩者完美重合,。圖9（下）顯示了排名第1,、3、4位分子式的理論譜圖的對比,，可以看出排序第4的分子式的同位素分布的誤差明顯大于前兩個(gè)分子式,，因此在實(shí)際的驗(yàn)證分析中，我們只需要考察前三個(gè)分子式,。
圖9：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較,；（下）排序1、3,、4位分子式的理論同位素分布比較
既然通過譜圖準(zhǔn)確度能幫我們準(zhǔn)確地將分子式鎖定在前3位,，那如果只考慮質(zhì)量精度，我們的TOF需要達(dá)到多少的精度才能幫助我們?nèi)フ业侥繕?biāo)分子式呢,？我們假設(shè)了理論的精確質(zhì)量為實(shí)測值,，重新進(jìn)行了sCLIPS分子式檢索，并將分子式的排序設(shè)定為按質(zhì)量誤差排序,，結(jié)果見圖10,。在得到的候選結(jié)果中，需要具有高于0.2ppm或0.02ppm的非常高的質(zhì)量精度,，才能分別在前3個(gè)或前2個(gè)候選元素中找到正確的元素組成,。
圖10：C43H74NO15的分子式檢索結(jié)果（按質(zhì)量誤差從小到大排序）
結(jié)論
1）四極桿質(zhì)譜上：[20mDa質(zhì)量精度+98.5%譜圖準(zhǔn)確度精度]=1.5ppm
20mDa (50ppm @ 400Da)的質(zhì)量誤差與98.5%的譜圖準(zhǔn)確度相結(jié)合，通過TrueCal可以在大多數(shù)單,、三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn),，等同于1.5ppm的質(zhì)量精度的分子式鑒定效果，且正確的分子式排在前5位,，這相當(dāng)于TOF的未知物鑒定水平,。
2）高分辨質(zhì)譜上：[5ppm質(zhì)量精度+98.0%譜圖準(zhǔn)確度]=0.2ppm
5ppm的質(zhì)量精度(@845Da)結(jié)合98.0%的譜圖準(zhǔn)確度,，可以在高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)等同于0.2ppm質(zhì)量精度的分子式鑒定效果,，且正確的元素組成排在前3位。3）在未知物的鑒定分析中，無需過分地追求更優(yōu)的質(zhì)量精度,，更好的質(zhì)量精度意味著更高的硬件投入成本,；而是應(yīng)該考慮質(zhì)量精度+譜圖準(zhǔn)確度的組合，在現(xiàn)有的質(zhì)譜系統(tǒng)上,，通過譜圖準(zhǔn)確度來提升質(zhì)譜系統(tǒng)的未知物鑒定潛力,。如四極桿質(zhì)譜+MassWorks軟件來達(dá)到TOF的未知物定性效果。
關(guān)于MassWorks
軟件MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件,，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS,、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量，并通過獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式,。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF,、Orbitrap）的定性分析。
關(guān)于綠綿科技
綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商,，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks,、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣、銷售,、售前/售后技術(shù)支持,、應(yīng)用支持。若您想了解獲取 MassWorks 產(chǎn)品的更多信息或應(yīng)用,，歡迎致電綠綿科技,！
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北京綠綿科技有限公司(簡稱：綠綿科技)以體現(xiàn)客戶服務(wù)價(jià)值為宗旨，以專業(yè)精神和技能為廣大實(shí)驗(yàn)室分析工作者提供樣品前處理,、樣品制備及分析,、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確分析和管理的全面解決方案，致力于協(xié)助客戶提高分析檢測的效率和水平,。主要代理產(chǎn)品聯(lián)系電話：010-82676061/2/3/4/5/6/7/8
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