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　　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS）是檢測mRNA疫苗和寡核苷酸的一個(gè)重要手段，其中一個(gè)典型的工作是通過質(zhì)譜圖中一系列多電荷離子的質(zhì)荷比（m/z）和電荷數(shù)（z）,，來計(jì)算分子的平均分子量,。

　　通常這一任務(wù)是在高分辨質(zhì)譜上完成，但在某些情況下,，其高昂的成本或較高的技術(shù)門檻,，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)室來說是一種挑戰(zhàn)。

　　低分辨的LC/MSD四極桿質(zhì)譜儀的采購成本和使用成本更低,，通過在系統(tǒng)中增加MassWorks質(zhì)譜校正軟件,，也可以讓四極桿LC/MS像高分辨質(zhì)譜那樣對(duì)多電荷的大分子（如蛋白、寡核苷酸,、聚合物等）進(jìn)行精確質(zhì)量分子量的測定,。

　　實(shí)驗(yàn)

　　儀器：安捷倫Infinity II 1290 -6135C LC/MSD XT

　　數(shù)據(jù)分析：Cerno MassWorks軟件

　　質(zhì)譜條件：全掃描 700-3000 m/z，數(shù)據(jù)采集模式為Profile,，采樣閾值設(shè)置為零（Threshold = 0）,。

　　樣品：寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品,，信息如表1。

　　表1：寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品信息

　　1. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)校正

　　在MassWorks 軟件中,，打開Agilent LC/MS調(diào)諧液的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（見圖1）,，選取目標(biāo)離子用于質(zhì)譜圖的精確質(zhì)量和峰型校正。

　　圖1：在MassWokrs選取LC/MS調(diào)諧液的標(biāo)準(zhǔn)離子用于質(zhì)譜校正

　　標(biāo)樣校正結(jié)果（見圖2）表明,，用于校正的8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)離子的絕對(duì)質(zhì)量偏差均小于1.6mDa,，相對(duì)質(zhì)量誤差小于2.6 ppm,，譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy）大于95%,，校正結(jié)果表現(xiàn)很好，可以用于后續(xù)的樣品數(shù)據(jù)的分析,。

　　圖2：質(zhì)譜校正結(jié)果

　　2. 結(jié)果與討論

　　寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品在安捷倫OpenLab CDS中的原始質(zhì)譜圖見圖3,，每個(gè)質(zhì)譜峰的m/z僅能測定至小數(shù)點(diǎn)后1位（0.1）。

　　圖3：OpenLab CDS的原始質(zhì)譜圖

　　經(jīng)MassWorks軟件校正處理后的寡核苷酸質(zhì)譜圖如圖4所示,，每個(gè)質(zhì)譜峰的m/z都被測定至小數(shù)點(diǎn)4位（0.0001）,。

　　圖4：經(jīng)MassWorks軟件校準(zhǔn)后的精確質(zhì)量質(zhì)譜圖

　　3. 手動(dòng)質(zhì)譜解卷積//分子量計(jì)算

　　分子量（MW）的計(jì)算是通過如圖5所示的一系列離子的電荷數(shù)（z）及m/z，并參考圖6的公式來進(jìn)行,。其中m1和m2是兩個(gè)相鄰質(zhì)譜峰的m/z值,，而X是加合物的質(zhì)量。當(dāng)比較該寡核苷酸原始質(zhì)譜圖和精確質(zhì)量質(zhì)譜圖的結(jié)果時(shí),，發(fā)現(xiàn)經(jīng)MassWorks得出的平均MW的不確定性顯著降低,，并且非常接近理論的MW。

　　圖5：分子量MW的計(jì)算結(jié)果（左：用OpenLab CDS中的“名義質(zhì)量”計(jì)算的分子量,；右：用MassWorks中的精確質(zhì)量計(jì)算的分子量）

　　圖6：電荷數(shù)Z和分子量MW的計(jì)算公式

　　4. 未知峰的分子量測定

　　對(duì)未知峰進(jìn)行了類似的計(jì)算,，同時(shí)檢查了較小的肩峰。共檢測到了3種不同的離子并計(jì)算了它們的相對(duì)濃度,。該未知峰主要為寡核苷酸的neutral形式,，其含量為80.64%，其它兩種離子的MW分別偏移了+22.26 Da和+38.65 Da,，表明是Na+和K+加合物,，結(jié)果見圖7。

　　圖7：未知峰的分子量測定

　　5. 多電荷離子譜圖準(zhǔn)確度模型（SAMMI）

　　由于寡核苷酸序列已知,，我們可以在MassWorks軟件中用SAMMI工具進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)分析,，同時(shí)我們還可以對(duì)其它的加合物或修飾物進(jìn)行確證分析。如在圖8的示例,，SAMMI能夠分配并解釋全部的質(zhì)譜峰,，整體的譜圖準(zhǔn)確度為86.3%，并且證實(shí)了寡核苷酸質(zhì)譜圖中Na+和K+加合物的存在,。

　　圖8：SAMMI分析寡核苷酸標(biāo)樣的結(jié)果

　　6. 結(jié)論

　　1）在低分辨率的單四極桿LC/MSD系統(tǒng)上,，通過MassWorks軟件的適當(dāng)校正獲得了寡核苷酸的精確質(zhì)量質(zhì)譜圖,。

　　2）通過手動(dòng)的分子量計(jì)算，比較了使用定義質(zhì)量和精確質(zhì)量分別計(jì)算平均分子量的結(jié)果,，結(jié)果表明MassWorks的精確質(zhì)量譜圖極大地提高了分析可信度,。

　　3）利用SAMMI工具進(jìn)行的未知物分析和寡核苷酸標(biāo)樣的分析均證實(shí)了Na+和K+加合物的存在，且譜圖準(zhǔn)確性高,。

　　關(guān)于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件,，能幫助我們?cè)诘头直媛实乃臉O桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質(zhì)量,，并通過獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式,。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析,。

　　關(guān)于綠綿科技

　　綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區(qū)的總代理商,，負(fù)責(zé)Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產(chǎn)品市場推廣,、銷售,、售前/售后技術(shù)支持、應(yīng)用支持,。

　　若您想了解獲取 MassWorks 產(chǎn)品的更多信息或應(yīng)用,，歡迎致電綠綿科技！